| Abstract | U sklopu doktorskog rada sintetizirani su novi diariletenski (DAE) derivati s pirenskim
fluoroforima i referentni sustavi u svrhu dobivanja potencijalnih molekulskih fotoprekidača.
Setom spektroskopskih metoda u potpunosti su opisana njihova spektroskopska svojstva i
fotokemijska reaktivnost u MeOH i vodenoj otopini, kao i njihove nekovalentne interakcije s
polinukleotidima različitih sekundarnih struktura, te proteinom albuminom iz goveđeg seruma
(BSA). Svi DAE derivati pokazali su sposobnost reverzibilne fotociklizacije središnje DAE
jezgre u MeOH i vodi, osim bis-pirenskog analoga koji se u vodenoj otopini mogao
fotokemijski zatvoriti (ciklizirati), ali ne i reverzibilno otvoriti (deciklizirati). Također, samo je
otvoreni (neciklizirani) bis-pirenski DAE derivat ostvario interakcije s DNA/RNA fleksibilnim
umetanjem u određene utore polinukleotida, dok se zatvoreni oblik DAE nije vezao na DNA i
RNA. Također, fleksibilni otvoreni oblik DAE vezao se na protein BSA na najmanje tri različita
vezna mjesta, za razliku od zatvorenog oblika koji je u dominantmoj interakciji samo s jednim
veznim mjestom. Preliminarna ispitivanja antiproliferalne aktivnosti na humanoj staničnoj liniji
karcinoma pluća A549, pokazala su da novi DAE derivati nisu toksični. Međutim, fluorescentni
bis-pirenski analog uspješno je ušao u stanicu i lokalizirao se u citoplazmi, pri čemu je njegovo
osvjetljavanje UV svjetlom (315-400 nm) uzrokovalo snažan fotoinducirani citotoksični
učinak, pripisan sposobnosti pirena da proizvodi reaktivne kisikove vrste (ROS) pod utjecajem
zračenja. U drugom dijelu doktorata istraživani su novi derivati asimetričnih cijaninskih boja koje se
međusobno razlikuju u vrsti terminalnog heterocikla, duljini metinskog mosta, vrsti
supstituenata na heterociklu i količini naboja. Primijenjene su spektroskopske i kalorimetrijske
metode kako bi se boje ispitale u prisutnosti biopolimera te ocijenila njihova sposobnost
biološkog oslikavanja. Monokationske, trimetinske AK-3 boje vezale su se za DNA/RNA u mikromolarnom afinitetu
(Log Ks = 5,4-6,5). Vrlo selektivan fluorescentni odgovor samo za AT-DNA u uvjetima suviška
DNA nad bojom, u kombinaciji s podjednako selektivnim AT-DNA ICD odgovorom u
uvjetima suviška boje nad DNA (pripisan stvaranju dimera), omogućuje određivanje AT-DNA
i pri submikromolarnim koncentracijama. Nadalje, alifatska boja s n-butilnim supstituentom za
razliku od boje s benzilnim supstituentom, pokazala je ICD signal vezanjem u veći AU-RNA
utor i AT sekvence u mješovitim sekvencama ct-DNA.
Dikationske, benzooksazolne i benzotiazolne monometinske AK-A boje s tioesterskom
skupinom, vezale su se za ds-DNA/RNA u mikromolarnom afinitetu (Log Ks = 5,0-6,2) snažno
stabilizirajući ds-uzvojnicu. Dominantan način vezanja AK-A boja za ds-DNA je interkalacija,
dok je glavno vezno mjesto boja za RNA njezin veći utor unutar kojega tvore agregate. U
vodenoj otopini spojevi ne pokazuju intrinzičnu fluorescenciju, dok se vezanjem na dsDNA/RNA značajno povećava intenzitet fluorescencije. U biološkim ispitivanjima spojevi su
pokazali zanemariv učinak na proliferaciju stanica i visoko selektivnu lokalizaciju u
mitohondrijima.
Višestruko pozitivno nabijene cijaninske boje opremljene 1,4-diazobiciklo[2,2,2]oktanskom
(DABCO) skupinom, također su pokazale mikromolarni afinitet (Log Ks = 5,9-6,9) prema dsDNA/RNA. Neke od predstavljenih boja imaju zanemarivi antiproliferativni učinak prema
humanim tumorskim stanicama, no vrlo učinkovito ulaze u stanicu, uz visoko selektivnu
lokalizaciju u mitohondrijima, što ih čini potencijalno korisnim novim fluorescentnim bojama
za mitohondrije u živim stanicama. |
| Abstract (english) | As part of the doctoral dissertation, new diarylethene (DAE) derivates with pyrene fluorophores and reference systems were synthesized for the purpose of obtaining potential molecular photoswitches. A set of spectroscopic methods fully described their spectroscopic and
photochemical properties in MeOH and aqueous solution, as well as their noncovalent
interactions with polynucleotides of different secondary structures and with the bovine serum
albumin (BSA). All DAE derivatives showed reversible photocyclization reactivity of the
central DAE nucleus in MeOH and water, except for the bis-pyrene analog, which could be
photochemically closed but not reversibly opened due to strong intramolecular interactions of
pyrene overlap with the closed DAE unit. Also, only the open bis-pyrene DAE derivative
interacted with DNA/RNA by flexible insertion into specific polynucleotide grooves, while the
self-folded closed form of DAE did not bind to DNA and RNA. For the same steric reasons,
flexible open DAE-bis-pyrene form was bound to at least three different binding sites in BSA,
while rigid, self-stacked closed-form interacted dominantly with only one BSA site.
Preliminary studies of antiproliferative activity on the human lung cancer cell line A549 have
shown that the new DAE derivatives are non-toxic. However, the fluorescent bis-pyrene analog
successfully entered cells and localized in the cytoplasm, whereby its illumination with UV
light (315-400 nm) caused a strong photoinduced cytotoxic effect, typical for pyrene-related
singlet oxygen species production. In the second part of the doctoral dissertation, new derivatives of asymmetric cyanine dyes were investigated, which differ from each other in the type of terminal heterocycle, the length of the
methine bridge, the type of substituents on the heterocycle, and the amount of charge.
Spectroscopic and calorimetric methods were applied to examine the dyes in the presence of
biopolymers and to evaluate their ability to bioimage. Monocationic, trimethyne AK-3 dyes bound to DNA/RNA at micromolar affinity (Log Ks =
5,0-6,9). A highly selective fluorescent response > 650 nm only for AT-DNA sequences at
excess of DNA over dye, combined with equally AT-DNA selective ICD response at dye/DNA
crowded conditions (attributed to dye-dimer formation) allows for determination of AT-DNA
at submicromolar concentrations. Furthermore, a comparison of aliphatic- and benzyl- dye
showed that only aliphatic- derivative revealed ICD band upon binding to AU-RNA major
groove and short AT-sequences in mixed sequence (ct-)DNA.
Dicationic, benzoxazole and benzothiazole monomethine AK-A dyes with a thioester group
bound to ds-DNA/RNA at micromolar affinity and strongly stabilized the ds-helix. The
dominant way of binding AK-A dyes to ds-DNA is intercalation, while the main binding site
in RNA is its major groove within which they form aggregates. In an aqueous solution, the
compounds do not show intrinsic fluorescence, while binding to ds-DNA/RNA significantly
increases the fluorescence intensity. In biological studies, the compounds showed a negligible
effect on cell proliferation and highly selective localization in mitochondria.
Multiple positively charged cyanine dyes substituted with the 1,4-diazobicyclo [2,2,2] octane
(DABCO) group showed a high affinity for ds-DNA/RNA. Some of the presented dyes combine
low antiproliferative effects against human tumor cells, with efficient cellular uptake, high
affinity towards ds-DNA/RNA, and remarkable fluorescent staining of mitochondria. |
