| Abstract | Cilj rada: utvrđivanje žarišta SNP-ova na HV-1 regiji u populaciji Bosne i Hercegovine, utvrđivanje zastupljenosti alternativnih inačica SNP-ova na utvrđenim žarištima, utvrđivanje zastupljenosti tipova mtDNA unutar procesiranih uzoraka, i kreiranje protokola za detekciju istih putem metode jednobazne ekstenzije. ----- Materijali i metode: iz uzorka od 300 bukalnih sluznica uzetih od nesrodnih pojedinaca izolirana je DNA, na kojoj je amplificirana HV-1 regija korištenjem univerzalnih početnica. Amplificirana HV-1 regija je prvo kvantificirana, a potom i sekvencirana Sangerovom metodom na automatiziranom DNA sekvenceru. Oslanjajući se na tako prikupljene podatke, kreirane su početnice specifične za odabrana žarišta, i provedena je njihova pojedinačna detekcija metodom jednobazne ekstenzije. Nakon toga, kreirane početnice su pomiješane u multipleks reakcije, koje su provedene prvo na individualnim uzorcima, te potom na miješanom uzorcima. U istraživanju provedenom u okviru ove disertacije korišteni su ABI BigDye v1.1, ABI SNAPShot i ABI Quantifiler kitovi, a strojna analiza je napravljena koristeći ABI 3130 Genetic Analyzer i ABI 7700 Sequence Detection System instrumente. ----- Rezultati: analizom elektroferograma sekvenciranja utvrđena su žarišta pojavljivanja SNP-ova, i izračunate zastupljenosti alternativnih inačica SNP-ova na njima. Dobivene sekvence HV-1 regije su podijeljene u 33 tipa mtDNA. Za sve tipove izračunate su vrijednosti GGIP (Gornje Granice Intervala Pouzdanosti), i LR (Likelihood Ratio). Rezultati analize jednobaznom ekstenzijom pokazali su se u potpunosti podudarni s rezultatima sekvenciranja po Sangeru, kako u reakcijama s pojedinačnim početnicama, tako i u multipleks reakcijama. Analize miješanih uzoraka DNA jasno su tipizirale oba tipa mtDNA prisutnih u mješavini. ----- Zaključci: na osnovu dobivenih rezultata, a u skladu s postavljenim ciljevima ovog istraživanja i njihove usporedbe s dosadašnjim istraživanjima, dolazi se do sljedećih zaključaka: izdvojeno je petnaest SNP žarišta čiji lokusi i zastupljenosti alternativne inačice SNP-a tvore jedinstvenu populacijsku studiju, što je izraženo različitim izračunatim vrijednostima statističke signifikantnosti podudaranja unutar kreirane studije naspram sličnih studija iz literature. Kreirana metoda detekcije profiliranja SNP-ova na utvrđenim žarištima jednobaznom ekstenzijom pokazala se funkcionalnom, a njeni rezultati u potpunosti podudarni s rezultatima sekvenciranja. Također, kreirana metoda detekcije jednobaznom ekstenzijom pokazala je visoku osjetljivost u tipiziranju miješanih uzoraka, području nepokrivenom metodom sekvenciranja po Sangeru. |
| Abstract (english) | Aim of this study was to establish locations of the SNP hotspots in the HV 1 region, their alternative allele frequencies, as well as creation of a protocol for their typing based on the single base extension (SBE). ----- Materials and Methods: DNA was extracted from buccal swabs taken from 300 unrelated individuals. Extracted DNA was first quantified using RT-PCR, and then amplified at the HV-1 region of the mtDNA with adequate primers. Resulting amplicons were sequenced by Sanger sequencing using an automated DNA sequencer. Relying on the data thus acquired, primers specific for the chosen hotspots were designed, and samples were typed using SBE method for each SNP in single reactions. After that, designed primers were mixed in multiplex reaction mixes, and samples were typed with those. Created mixed samples from two different DNAs were tested with both singleplex and multiplex reactions. ----- Results: SNP hotspots and their alternative allele frequencies were determined. Taking these in consideration 33 mtDNA types were observed, with Upper Confidence Interval values and Likelihood Ratios calculated for each type. Results obtained from SBE typing protocol of the samples were identical to Sanger sequencing, both in singleplex and multiplex reactions. SBE protocol successfully typed mixed DNA samples. ----- Conclusion: Taking into consideration both the loci and the alternative allele frequencies of selected 15 SNPs, it can be concluded that they make a unique population study, which is shown with comparing calculations of the given mtDNA profile uniqueness using this study data and the data from studies found in the literature. Chosen SNP typing by the SBE protocol has shown itself functional, with results absolutely matching those acquired with Sanger sequencing. Furthermore, SBE protocol has shown high sensitivity in typing mixed DNA samples. |
