| Abstract | Background: Botulinum toxin type A (BoNT/A) is an emerging long-acting therapeutic for chronic pain. In contrast to previously assumed local action, novel evidence point to the CNS as the possible site of BoNT/A action on pain after its axonal transport. The aim of this thesis was to characterize the sites and mechanisms of BoNT/A action on central pain transmission. ----- Methods: BoNT/A antinociceptive activity was characterized by behavioral nociceptive assessment, immunodetection of BoNT/A enzymatic product (cleaved synaptosomal-associated protein 25 (SNAP-25)) and c-Fos neuronal activation in different rat sensory regions. Peripheral, intraneural and intraganglionic BoNT/A injections, and microtubule-blocker colchicine were employed to assess BoNT/A axonal transport in peripheral sensory nerves. By employing trigeminal nerve ablation we examined possible transcytosis of BoNT/A in sensory regions. Denervation of trigeminal afferents with capsaicin was employed to examine the potential role of capsaicin-sensitive (vanilloid 1-expressing) neurons. ----- Results: Microtubule-dependent axonal transport of BoNT/A, necessary for its antinociceptive activity, occurred in sensory neurons. Following different toxin peripheral injections, cleaved SNAP-25 has been observed in corresponding sensory nuclei of brainstem (trigeminal nucleus caudalis) and spinal cord dorsal horn, but not in higher level sensory areas. BoNT/A enzyme activity was localized presynaptically in capsaicin-sensitive (vanilloid 1 receptor -expressing) central afferent terminals. BoNT/A reduced the pain-associated neuronal activation in TNC and supramedullary regions involved in descending pain control. ----- Conclusion: After its axonal transport in sensory neurons, BoNT/A modulates pain transmission at the central synapse of primary afferents. Involvement of capsaicin-sensitive neurons is associated with the selectivity of BoNT/A action for pain hypersensitivity. These findings contribute to the explanation of BoNT/A mechanisms of action in pain and possible refinement of its clinical use. |
| Abstract (croatian) | UVOD I CILJ ISTRAŽIVANJA: Botulinum toksin tipa A (BoNT/A), neurotoksin iz anaerobne bakterije Clostridium botulinum, je jedan od najpotentnijih bioloških toksina. Ulaskom u živčane terminale uzrokuje enzimsko cijepanje sinaptosomalnog proteina molekulske mase od 25 kDa (eng. synaptosomal-associated protein of 25 kDa; SNAP-25), što sprječava lučenje neurotransmitora. Intoksikacija organizma preko hrane ili infekcija sporama bakterija pri određenim uvjetima uzrokuje neuroparalitičku bolest botulizam koju karakterizira kljenut mišića. Pročišćeni farmakološki pripravak u malim dozama se koristi kao terapija određenih hiperkinetskih poremećaja pokreta i autonomnih poremećaja, te kao kozmetički pripravak za smanjenje bora. Zbog dugotrajnog djelovanja nakon jednokratne primjene koji traje nekoliko mjeseci BoNT/A se sve više koristi u liječenju određenih tipova kronične boli. BoNT/A je odobren za liječenje kronične migrene, a njegova učinkovitost je pokazana kod niza drugih bolnih poremećaja, poput različitih vrsta neuropatskih boli, artritisa, boli u leđima, temporomandibularnih poremećaja, miofascijalne boli, itd. Zajedničko obilježje svih navedenih poremećaja je postojanje bolne preosjetljivosti i centralne senzitizacije. Posebne prednosti njegove primjene, osim dugotrajnog djelovanja, su manje nuspojave nego kod konvencionalnih analgetika poput opioida, te manjak utjecaja na transmisiju akutne nociceptivne boli.
Unatoč sve značajnijoj kliničkoj uporabi, malo se zna o mjestu i mehanizmu antinociceptivnog djelovanja BoNT/A. Prevladavajuće hipoteze predložene od strane proizvođača farmakološkog pripravka su da BoNT/A sprječava lokalno lučenje neurotransmitora glutamata i neuropeptidnih posrednika upale s perifernih senzornih završetaka, te na taj način inhibira perifernu transmisiju boli. Novi eksperimenti, poglavito iz našeg laboratorija, upućuju na manjak povezanosti perifernog učinka BoNT/A s njegovim antinociceptivnim djelovanjem. U bilateralnim modelima boli, BoNT/A je nakon jednostrane primjene pokazao bilateralan antinociceptivni učinak, ovisan o aksonalnom transportu kroz periferne neurone. Ti eksperimenti, potvrđeni na nekoliko eksperimentalnih modela, su ukazali na moguće centralno mjesto djelovanja BoNT/A posredovano aksonalnim transportom. Stoga, cilj ovog doktorata je bilo ispitati mogući aksonalni transport molekula BoNT/A u središnji živčani sustav kroz senzorne neurone, okarakterizirati mjesta njegova djelovanja na centralnu transmisiju boli, te ispitati mehanizam selektivnosti djelovanja na bolnu preosjetljivost u odnosu na akutnu senzornu transmisiju. ----- METODE: Moguće djelovanje enzimski aktivnog BoNT/A u centralnim senzornim regijama štakora je istraženo imunodetekcijom enzimskog produkta djelovanja BoNT/A (pocijepani odn. krnji SNAP-25) nakon različitih načina periferne primjene: subkutanog davanja u područje trigeminusa (područje brkova na licu) ili u stražnju šapicu, te nakon injiciranja u mišić gastrocnemius ili nakon direktne injekcije u izolirani ishijadikus. Paralelno s mikroinjiciranjem u ishijadikus primijenili smo i kolhicin, kako bismo potvrdili mogući aktivni mikrotubularni mehanizam aksonalnog transporta kroz periferne živce. Da bismo potvrdili ulogu aksonalnog transporta BoNT/A kroz senzorne neurone, antinociceptivno djelovanje BoNT/A je ispitano u modelu orofacijalne boli uzrokovane formalinom nakon periferne i(ili) intraganglijske primjene BoNT/A, i intraganglijskog kolhicina.
Nakon davanja toksina u područje lica, imunohistokemijskom lokalizacijom pocijepanog SNAP-25 smo pokušali utvrdili mjesto djelovanja BoNT/A u središnjem živčanom sustavu. Pojava pocijepanog SNAP-25, osim u kaudalnoj jezgri trigeminusa, je ispitana i u supraspinalnim senzornim regijama poput talamusa, moždane kore, hipotalamusa, locus coeruleus-a itd. Ablacijom trigeminalnog živca smo provjerili mogućnost transcitoze BoNT/A u kaudalnoj jezgri trigeminusa. Pokusima u kojima smo primijenili konfokalnu mikroskopiju smo provjerili kolokalizaciju pocijepanog SNAP-25 s neuronskim i staničnim markerima sinapsi, aksona, dendrita, neuronskih jezgri, astrocita itd. Kako bismo dodatno istražili regionalna mjesta djelovanja BoNT/A na centralnu transmisiju boli, istražili smo neuronsku aktivaciju u trigeminalnoj jezgri i drugim supraspinalnim nociceptivnim regijama imunohistokemijskom analizom ekspresije c-Fos proteina nakon bolnog podražaja uzrokovanog formalinom.
Budući da BoNT/A ne djeluje na akutnu transmisiju boli i ostalih senzornih podražaja, ispitali smo moguću povezanost njegova antinociceptivnog djelovanja s neuronima osjetljivim na kapsaicin. Nakon injekcije BoNT/A u trigeminalnu regiju, istražili smo pojavnost pocijepanog SNAP-25 u kapsaicin-osjetljivim neuronima kolokalizacijom pocijepanog SNAP-25 s vaniloidnim-1 receptorom prolaznog receptorskog potencijala (TRPV1), te denervacijom trigeminalnih aferentnih neurona s intraganglijskom injekcijom visoke doze kapsaicina (2%). Denervacijskim postupkom također smo istražili ulogu kapsaicin-osjetljivih nociceptora pri antinocicepcijskom djelovanju BoNT/A u modelu orofacijalne boli uzrokovane formalinom.
Dalje, ispitali smo moguću povezanost djelovanja BoNT/A i neuropeptida povezanog s genom za kalcitonin (eng. calcitonin gene-related peptide, CGRP), koji posreduje središnju senzitizaciju kod boli i migrene. Mogući utjecaj BoNT/A na lučenje i ekspresiju CGRP-a smo istražili imunodetekcijskim mjerenjem koncentracije CGRP-a u cerebrospinalnom likvoru pri različitim bolnim podražajima metodama enzimske imunoadsorpcijske analize (ELISA) i radioimunološkog testa. Nadalje, ispitali smo kolokalizaciju CGRP-a i pocijepanog SNAP-25 u trigeminalnoj jezgri i kranijalnoj duri, te utjecaj perifernog BoNTA na ekspresiju CGRP-a u gangliju, kranijalnoj duri i trigeminalnoj jezgri. ----- REZULTATI: Pocijepani SNAP-25 se nakon različitih mjesta periferne primjene BoNT/A pojavio u odgovarajućim senzornim nociceptivnim regijama (trigeminalna kaudalna jezgra i stražnji rog leđne moždine. Također, pocijepani SNAP-25 se pojavio i u prednjem rogu leđne moždine. Pojava pocijepanog SNAP-25 u leđnoj moždini nakon primjene BoNT/A u periferni živac je spriječena blokadom aksonalnog transporta pomoću kolhicina. BoNT/A primijenjen periferno i intraganglijski je smanjio bolnu preosjetljivost kod štakora u drugoj fazi formalinskog testa. Kolhicin primijenjen intraganglijski spriječio je antinociceptivno djelovanje BoNT/A na drugu fazu orofacijalnog formalinskog testa.
Nakon ablacije trigeminalnog živca došlo je do unilateralne osjetne denervacije, ali i nestanka imunoreaktivnosti pocijepanog SNAP-25 u kaudalnoj jezgri trigeminusa, što ukazuje na enzimsku aktivnost BoNT/A u središnjim završecima osjetnih neurona. Kolokalizacija pocijepanog SNAP-25 je pokazala da je enzimski aktivni BoNT/A bio prisutan u središnjim sinapsama i aksonima. Pocijepani SNAP-25 nakon periferne primjene BoNT/A nije bio vidljiv u supraspinalnim regijama. BoNT/A je smanjio nociceptivnu aktivaciju neurona (mjerenu pomoću ekspresije c-Fos proteina) u kaudalnoj jezgri trigeminusa, locusu coeruleusu i periakveduktalnoj sivoj tvari.
Pocijepani SNAP-25 se nakon facijalne primjene pojavio u središnjim živčanim završecima neurona osjetljivih na kapsaicin koji izražavaju TRPV1 receptor. Učinak BoNT/A na orofacijalnu bol uzrokovanu formalinom, te pojava pocijepanog SNAP-25 u CNS-u su spriječeni denervacijom neurona osjetljivih na kapsaicin.
Mjerenjem koncentracije CGRP-a u cerebrospinalnom likvoru nije bilo moguće utvrditi utjecaj BoNT/A na središnje lučenje neuropeptida. Kod eksperimentalne boli uzrokovane injekcijom Freundovog adjuvansa u područje čeljusnog zgloba, BoNT/A je značajno spriječio pojačanu ekspresiju CGRP-a u kranijalnoj duri. U trigeminalnoj jezgri nije bilo značajne kolokalizacije pocijepanog SNAP-25 i CGRP-a. dok se pocijepani SNAP-25 u kranijalnoj duri pojavio u aferentima koji sadrže CGRP. ----- ZAKLJUČCI: Aksonalni transport enzimski aktivnog BoNT/A kroz senzorne neurone posredovan mikrotubulima odgovoran je za njegovo djelovanje na bol. Antinociceptivni učinak BoNT/A je povezan s njegovom enzimskom aktivnošću na centralnim završecima senzornih neurona osjetljivih na kapsaicin. Djelovanje BoNT/A na bol i centralnu senzitizaciju je praćeno smanjenjem aktivacije neurona u dorzalnom rogu i nekim supramedularnim regijama uključenima u silaznu inhibiciju boli. Selektivna uključenost neurona osjetljivih na kapsaicin objašnjava i selektivnost djelovanja BoNT/A na alodiniju i hiperalgeziju kod određenih kroničnih bolnih stanja, te manjak učinka na normalni prijenos akutne nociceptivne boli. Nalaz da BoNT/A smanjuje neurotransmisiju CGRP-a u kranijalnoj duri mogao bi objasniti njegov učinak na kroničnu migrenu. Ovi nalazi doprinose razumijevanju djelovanja BoNT/A na bolne poremećaje i mogućem poboljšanju njegove kliničke primjene. |
