| Abstract | Cilj rada: kompjutorskom slikovnom analizom citoloških uzoraka aspirata endometrija odrediti morfometrijske i kinetičko-proliferativne parametre u svrhu citodijagnostičke procjene proliferativnog, hiperplastičnog i malignog endometrija. ----- Bolesnice i metode rada: Na arhivske citološke uzorke aspirata endometrija, klasificirane prema patohistološkim dijagnozama (proliferacija, hyperplasia symplex-HS, hyperplasia complex-HC, hyperplasia complex atypica-HA, adenocarcinoma gradus I,II,III-adenoCa gr. I,II,III) standardno obojane metodom po Papanicolaou-u (ukupno n=77: proliferacija - n=12, HS - n=13, HC- n=12, HA - n=10, adenoCa gr. I - n=10, adenoCa gr. II - n=10; adenoCa gr. III –n =10) primjenjena je metoda za prikazivanje srebrom obojanih nukleolarnih organizacijskih regija (AgNOR), a na obojane po May-Grünwald-Giemsa-i, MGG (ukupno n=81: proliferacija - n=12, HS - n=13; HC - n=13; HA – n=10, adenoCa gr. I - n=12; adenoCa gr. II - n=10; adenoCa gr. III - n=11), metoda bojanja po Feulgenu, za statičku DNK analizu (ICM). Digitalna slikovna analiza izvršena je na osobnom računalu primjenom softverskog paketa «SFORM», firme VAMSTEC, Zagreb. Interaktivna morfometrijska analiza jezgre (površina i opseg, najduži i najmanji polumjer, konveksitet, duljina i širina, «fakor pravilnosti» i «faktor izduženosti»), vršena je na najmanje 50 (bojanje po Papanicolaou-u) odnosno 100 (bojanje po MGG-u) dobro očuvanih jezgara epitelnih endometralnih stanica bez preklapanja, pri povećanju od 1000x. Kvantitativnom kompjutorskom obradom slike analiziran je AgNOR u jezgri (broj, ukupna, srednja, najmanja i najveća površina pojedinačnih AgNOR-a i AgNOR nakupina, zatim broj, ukupna i relativna površina ukupnog AgNOR-a te raspodjela triju i pet veličina AgNOR-a po uzorku). Za DNK statičku analizu, izračunat je integrirani optički denzitet (IOD) za svaku ispitivanu jezgru i internu kontrolu (limfociti, uz faktor korekcije). Ploidija je određena prema DNK indeksu (DI), tipu histograma i količini DNK vrijednosti >5c i >9c. S-faza je izražena prema van Velthoven-u i sur., Cornelisse-u i sur. i raspodjeli IOD vrijednosti od 2,5c – 3,5c. Također su analizirani postoci stanica u vršku («peak») histograma (2N;2c) i poslije vrška histograma (2N-4N). Statistička analiza podataka učinjena je na osobnom računalu (PC) primjenom statističkog programskog paketa “Statistica” ver. 8.0. ----- Rezultati: Multivarijatnom analizom (ANOVA) razlikuju se maligni, hiperplastični i proliferativni endometrij po svim morfometrijskim varijablama jezgre u oba bojanja (p<0,05). Međutim, međusobnim testiranjem skupina (Kruskal-Wallis test) hiperplazije bez atipija značajno se ne razlikuju jedino po faktoru pravilnosti i izduženosti (p>0,05) od atipične hiperplazije, adenokarcinoma i proliferativnog endometrija (bojanje po Papanicolaou-u), odnosno maligni i atipični hiperplastični endometrij (MGG bojanje) statistički se značajno razlikuju (p<0,05) s obzirom na sve mjerene parametre od proliferativnog i hiperplastičnog endometrija bez atipija, osim za faktor pravilnosti jezgre (p>0,05). S obzirom na citološko bojanje, morfometrijski parametri su znatno veći u MGG obojanim aspiratima materišta, što je i statistički značajno (p<0,05), osim za faktor pravilnosti i faktor izduženosti jezgre (p>0,05) kod jednostavne i složene hiperplazije, odnosno kod dobro diferenciranog adenokarcinoma (faktor pravilnosti) i atipične hiperplazije (faktor izduženosti) uspoređujući oba bojanja. Broj pojedinačnog AgNOR-a, AgNOR nakupina i ukupnog AgNOR-a raste od proliferativnog endometrija, hiperplazija bez i s atipijom do adenokarcinoma različitog stupnja zrelosti (p<0,05). Međusobnim uspoređivanjem razlikuju se (p<0,05) proliferativan i hiperplastičan endometrij bez atipije: od karcinoma endometrija (broj pojedinačnog AgNOR-a), atipične hiperplazije i adenokarcinoma svih stupnjeva diferenciranosti (broj AgNOR nakupina), odnosno karcinoma svih stupnjeva zrelosti (broj ukupnog AgNOR-a). Atipična hiperplazija i dobro diferencirani adenokarcinom endometrija također se razlikuju i po ukupnom broju AgNOR-a (p<0,05). Proliferativan, hiperplastičan i maligan endometrij međusobno se razlikuju po površini ukupnog AgNOR-a i ukupnoj površini AgNOR nakupina (p<0,05), osim za hiperplazije bez atipije (p<0,05). Hyperplasia complex značajno se razlikuje (p<0,05) od svih skupina po prosječnoj površini AgNOR nakupina i prosječnoj površini ukupnog AgNOR-a u jezgri (p<0,05). Raspodjelom AgNOR-a prema veličini površine međusobno se razlikuju proliferativan, hiperplastičan i maligan endometrij (p<0,05), osim atipične hiperplazije i dobro diferenciranog karcinoma (raspodjela na 5 podskupina) odnosno složene hiperplazije i dobro diferenciranog adenokarcinoma (raspodjela na 3 podskupine). Veliki AgNOR češće je prisutan u proliferaciji i karcinomu, nego kod hiperplazija. U proliferativnom endometriju i jednostavnoj hiperplaziji, najčešće je prisutan 1 i/ili 2 AgNOR-a, dok se ≥5AgNOR-a nalazi pretežno u malignom endometriju. Količina DNK izražena kao integrirana optička gustoća (IOD) raste od proliferacije i hiperplazija bez i s atipijom do karcinoma endometrija različitog stupnja zrelosti. Razlika je statistički značajna (p<0,05) osim za atipičnu hiperplaziju i proliferaciju (p>0,05). Diploidni DNK indeks (prema van Velthoven-u i sur.) nalazi se u proliferaciji, složenoj hiperplaziji bez i s atipijom te dobro diferenciranom adenokarcinomu endometrija, a aneuploidni u jednostavnoj hiperplaziji (granična vrijednost DNK indeksa) te srednjem i slabo diferenciranom adenokarcinomu endometrija. U svima citološkim uzorcima aspirata endometrija nalazi se <1% DNK sadržaja >5c (p<0,05), osim kod srednje i slabo diferenciranog adenokarcinoma endometrija (>1%). Međusobnim uspoređivanjem razlike su značajne (p<0,05), samo za slabo diferencirani adenokarcinom endometrija u odnosu prema proliferaciji, jednostavnoj i atipičnoj hiperplaziji. DNK sadržaj >9c (<1%) uočen je samo u složenoj hiperplaziji i slabo diferenciranom adenokarcinomu endometrija. Međusobnim uspoređivanjem skupina nema statistički značajne razlike (p>0,05). Također nema statistički značajne razlike u postotku stanica u S-fazi staničnog ciklusa među skupinama, osim, prema van Velthoven-u, za proliferaciju u odnosu na srednje i slabo diferenicrani adenokarcinom (p<0,05). Količina DNK sadržaja u vršku histograma (2N; 2c) razlikuje se kod slabo diferenciranog karcinoma endometrija u odnosu na hiperplazije bez i s atipijom (p<0,05), dok nema razlike u DNK sadržaju u 4N (4c), odnosno od 2N(2c) do 4N(4c), za cjelokupan uzorak, odnosno međusobnim uspoređivanjem skupina (p>0,05). Primjenom diskriminacijske multivarijatne analize izdvojeno je 8 (bojanje po Papanicolaou-u, AgNOR analiza) odnosno 10 (MGG i DNK analiza) varijabli koje omogućuju predviđanje patohistološke dijagnoze u 77,3% odnosno 68% citoloških uzoraka aspirata endometrija. Ukoliko se primjeni diskriminacijska multivarijatna analiza na cjelokupan uzorak (dva standardna bojanja, AgNOR i DNK analiza) izdvaja se ukupno 14 varijabli: morfometrijske varijable AgNOR-a (ukupna površina, ukupni broj) i jezgre (površina i opseg jezgre kod oba bojanja, maksimalni i minimalni polumjer i širina jezgre u preparatima obojanim samo po Papanicolaou-u) te DNK citometrijske varijable (IOD, >4N, >5N, >9N, S-faza po Cornelisse-u) omogućavajući predviđanje patohistološke dijagnoze u 92% citoloških uzoraka. Karcinom endometrija otkriva se u 96,4%, atipična i jednostavna hiperplazija u 100 %, a složena hiperplazija u 83,3% citoloških uzoraka aspirata endometija. ----- Zaključak: Digitalna slikovna analiza primjenjena na standardno obojane i morfološki analizirane uzorke aspirata endometrija, uz dodatnu AgNOR i DNK analizu, omogućava otkrivanje jasno malignih i ranih patoloških promjena endometrija, odvajajući skupine rizičnih pacijentica za nastanak karcinoma endometrija. Preklapanje pojedinih morfometrijskih i kinetičkih parametara (AgNOR, DNK) može se prevladati, uz temeljnu citomorfološku analizu, primjenom njihove kombinacije, uključujući i kliničke podatke. |
| Abstract (english) | Aim. Using computer assisted image analysis of endometrial aspirate cytology samples, to determine morphometric and kinetic-proliferative parameters for cytodiagnostic assessment of proliferative, hyperplastic and malignant endometrium. ----- Patients and methods. The method of silver stained nucleolar organizer region (AgNOR) imaging was employed for archival endometrial aspirate cytology samples classified according to histopathologic diagnoses (proliferation, hyperplasia simplex (HS), hyperplasia complex (HC), hyperplasia complex atypica (HA), adenocarcinoma grade I, II, III (adenoCa gr. I, II, III)) stained by standard Papanicolaou method (N=77; proliferation, n=12; HS, n=13; HC, n=12; HA, n=10; adenoCa gr. I, n=10; adenoCa gr. II, n=10; adenoCa gr. III, n=10); whereas the method of staining according to Feulgen for static DNA analysis (ICM) was used for samples stained by May-Grünwald-Giemsa (MGG) method (N=81; proliferation, n=12; HS, n=13; HC, n=13; HA, n=10; adenoCa gr. I, n=12; adenoCa gr. II, n=10; adenoCa gr. III, n=11). Digital image analysis was performed on a PC by use of the SFORM software (VAMSTEC, Zagreb). Interactive morphometric analysis of the nucleus (area and outline, maximal and minimal radius, convexity, length and breadth, factor of regularity and factor of elongation) was performed on at least 50 (Papanicolaou stain) and 100 (MGG stain) well preserved nuclei of epithelial endometrial cells without overlap, at a magnification of X1000. Quantitative computer image processing was used to analyze nuclear AgNOR (number; total, medium, minimal and maximal area of single AgNORs and cluster AgNORs; number, total and relative area of total AgNOR; and distribution of three and five AgNOR sizes per sample). On static DNA analysis, integrated optic density (IOD) was calculated for each nucleus and internal control (lymphocytes, with correction factor). Ploidy was determined by DNA index (DI), type of histogram and amount of >5c and >9c DNA value. S-phase was expressed according to van Velthoven et al., Cornelisse et al. and distribution of 2.5c-3.5c IOD values. The percentage of cells in the histogram peak (2N; 2c) and post-peak (2N-4N) was also analyzed. Statistical data analysis was done on a PC using the Statistica Ver. 8.0 software. ----- Results. Multivariate analysis (ANOVA) differentiated malignant, hyperplastic and proliferative endometrium according to all nuclear morphometric variables with both staining methods (P<0.05). However, testing of hyperplasia groups without atypia (Kruskal-Wallis test) showed them not to differ statistically significantly from atypical hyperplasia, adenocarcinoma and proliferative endometrium (Papanicolaou stain) only according to the factor of regularity and factor of elongation (P>0.05), whereas malignant and atypical hyperplastic endometrium (MGG stain) differed statistically significantly from proliferative and hyperplastic endometrium without atypia according to all study parameters except for the factor of nuclear regularity (P>0.05). Comparing the two methods of cytologic staining, morphometric parameters were statistically significantly higher (P<0.05) in MGG stained endometrial aspirates, except for the factor of nuclear regularity and factor of nuclear elongation (P>0.05) in hyperplasia simplex and hyperplasia complex, well-differentiated adenocarcinoma (factor of nuclear regularity) and atypical hyperplasia (factor of nuclear elongation). The number of single AgNORs, cluster AgNORs and total AgNOR increased from proliferative endometrium through hyperplasia without and with atypia to adenocarcinoma of various degrees of maturity (P<0.05). On comparison, proliferative and hyperplastic endometrium without atypia differed (P<0.05) from endometrial carcinoma (number of single AgNORs), atypical hyperplasia and adenocarcinoma of all stages of differentiation (number of cluster AgNORs), and carcinoma of all degrees of maturity (total AgNOR number). Atypical hyperplasia and well-differentiated endometrial adenocarcinoma also differed according to total AgNOR number (P<0.05). Proliferative, hyperplastic and malignant endometrium differed according to total AgNOR area and total cluster AgNOR area (P<0.05), except for hyperplasia without atypia (P<0.05). Hyperplasia complex differed significantly (P<0.05) from all groups according to the mean cluster AgNOR area and mean total AgNOR area in the nucleus (P<0.05). AgNOR distribution according to area size distinguished proliferative, hyperplastic and malignant endometrium (P<0.05), with the exception of atypical hyperplasia and well-differentiated carcinoma (distribution into 5 subgroups), hyperplasia complex and well-differentiated adenocarcinoma (distribution into 3 subgroups). Large AgNOR was more commonly present in proliferation and carcinoma than in hyperplasia. One and/or two AgNORs were mostly present in proliferative endometrium and hyperplasia simplex, whereas ≥5 AgNORs were predominantly found in malignant endometrium. The amount of DNA expressed as IOD increased from proliferation and hyperplasia without and with atypia to endometrial carcinoma of various degrees of maturity. The difference was statistically significant (P<0.05), with the exception of atypical hyperplasia and proliferation (P>0.05). Diploidy DNA index (according to van Velthoven et al.) was recorded in proliferation, hyperplasia complex without and with atypia, and differentiated endometrial adenocarcinoma, whereas aneuploidy DNA index was found in hyperplasia simplex (borderline value of DNA index), and in medium and poorly differentiated endometrial adenocarcinoma. All endometrial cytologic aspirates contained <1% of >5c DNA content (P<0.05), except for intermediary and poorly differentiated endometrial adenocarcinoma (>1%). Their comparison yielded significant differences (P<0.05), for poorly differentiated endometrial adenocarcinoma versus proliferation, hyperplasia simplex and atypical hyperplasia. The >9c DNA content (<1%) was only recorded in hyperplasia complex and poorly differentiated endometrial adenocarcinoma. Group comparison showed no statistically significant difference (P>0.05). There was no statistically significant between-group difference in the percentage of cells in the S-phase of cell cycle, except for, according to van Velthoven et al., proliferation versus medium and poorly differentiated adenocarcinoma (P<0.05). The amount of DNA content in the histogram peak (2N; 2c) differed between poorly differentiated endometrial carcinoma and hyperplasia without and with atypia (P<0.05), whereas no such difference was observed in DNA content of 4N (4c) and from 2N(2c) to 4N(4c) in the sample as a whole or on group comparison (P<0.05). Discriminative multivariate analysis identified 8 (Papanicolaou stain, AgNOR analysis) and 10 (MGG and DNA analysis) variables able to predict the histopathologic diagnosis in 77.3% and 68% of endometrial cytologic aspirates, respectively. When discriminative multivariate analysis was applied on the sample as a whole (two standard stains, AgNOR and DNA analysis), the following 14 variables were identified: morphometric variables of AgNOR (total area, total number) and nucleus (nuclear area and outline on both stains, minimal and maximal radius and nucleus bredth only in Papanicolaou stained preparations), and DNA cytometric variables (IOD, >4N, >5N, >9N, S-phase according to Cornelisse et al.), able to predict the histopathologic diagnosis in 92% of cytologic samples. Endometrial carcinoma was detected in 96.4%, atypical hyperplasia and hyperplasia simplex in 100%, and hyperplasia complex in 83.3% of endometrial cytologic aspirate samples. ----- Conclusion. Digital image analysis along with AgNOR and DNA analysis enables detection of clearly malignant and early pathologic endometrium lesions, differentiating the groups of patients at risk of endometrial carcinoma development. Overlapping of particular morphometric and kinetic parameters (AgNOR, DNA) can be overcome with thorough cytomorphological analysis and use of their combinations, including clinical data. |
