| Abstract | Glikani su molekule koje sadrže više monosaharida povezanih glikozidnim vezama te se često povezuju s proteinima ili lipidima tvoreći tako različite glikokonjugate. Glikani su evolucijom postajali sve kompleksniji te su počeli dobivati značajne funkcionalne uloge ključne za složene organizme. Iz tog je razloga ključno uključiti glikansku analizu prilikom određivanja fiziologije, patofiziologije, etiologije ili dijagnostike nekih bolesti.
Analiza glikana najčešće se izvodi derivatizacijom glikana pri čemu je najčešće korištena metoda vezanje fluorofora reakcijom reduktivne aminacije nakon čega se obilježeni glikani najčešće analiziraju UPLC-MS metodama. Prilikom odabira fluorofora kojim će se obilježiti N-glikan, potrebno je razmišljati o njegovoj prikladnosti i svojstvima u metodi koja će se koristiti. Konkretno, kod HILIC-UPLC-FLR-ESI-MS metode, potrebno je razmišljati o fluorescenciji i ionizaciji fluorofora. Kako glikani sami nemaju prirodni kromofor, intenzitet fluorescencijskog signala dolazi od fluorofora. Samim time, ako fluorofor slabo fluorescira, tada se signali relativno manjih intenziteta neće dovoljno dobro izdignuti iznad bazne linije te analiza takvih glikana može biti otežana ili nemoguća. S druge strane, fluorofor značajno doprinosi ionizaciji glikana, pogotovo ako ima funkcionalne skupine koje se lako protoniraju, odnosno deprotoniraju, ovisno o kojem se MS modu radi.
Iz tog razloga, ukazuje se potreba za dizajnom fluorofora koji će više doprinositi fluorescenciji i ionizaciji glikana te potreba za kvantifikacijom tih doprinosa kako bi se unaprijedile metode analize glikana koje uključuju negativni MS mod budući da su te metode informativnije od metoda koje uključuju pozitivni MS mod.
U tu je svrhu provedena analiza N-glikana obilježenih s 11 različitih fluorofora. Potom je određena korelacija LogP i pKa različitih fluorofora i omjera intenziteta signala i šuma u negativnom MS modu. Na taj je način pokazano kako lipofilnost značajno više doprinosi omjeru intenziteta signala i šuma u masenom spektru od pKa, odnosno negativnog naboja u slučaju negativnog MS moda. S tim na umu, predlažu se daljnja istraživanja i razvoj fluorofora koji će biti pogodni za analizu glikana u negativnom MS modu. |
| Abstract (english) | Glycans are molecules that contain multiple monosaccharides linked by glycosidic bonds and often bind to proteins or lipids to form various glycoconjugates. Glycans became more and more complex with evolution and began to acquire significant functional roles crucial for complex organisms. For this reason, it is crucial to include glycan analysis when determining the physiology, pathophysiology, etiology, or diagnosis of some diseases.
Glycan analysis is most often performed by glycan derivatization, where the most commonly used method is the binding of fluorophores by a reductive amination reaction, after which the labeled glycans are most often analyzed by UPLC-MS methods. When choosing a fluorophore to label an N-glycan, it is necessary to think about its suitability and properties in the method which will be used. In particular, with the HILIC-UPLC-FLR-ESI-MS method, fluorescence and ionization of fluorophores need to be considered. As glycans themselves do not have a natural chromophore, the intensity of the fluorescence signal comes from the fluorophore. Thus, if the fluorophore fluoresces poorly, then signals of relatively lower intensities will not rise well enough above the baseline and analysis of such glycans may be difficult or impossible. On the other hand, fluorophore significantly contributes to the ionization of glycans, especially if it has functional groups that are easily protonated or deprotonated, depending on the MS mode.
For this reason, there is a need to design fluorophores that will contribute more to the fluorescence and ionization of glycans and the need to quantify these contributions to improve glycan analysis methods involving negative MS mode as these methods are more informative than methods involving positive MS mode.
For this purpose, an analysis of N-glycans labeled with 11 different fluorophores was performed. The correlation of LogP and pKa of different fluorophores and signal-to-noise intensity ratios in the negative MS mode was then determined. In this way, it was shown that lipophilicity significantly contributes more to signal-to-noise intensity ratios in the mass spectrum than pKa, ie negative charge in the case of negative MS mode. With this in mind, further research and development of fluorophores that will be suitable for glycan analysis in the negative MS mode are proposed. |
