Cilj ovog diplomskog rada bio je razviti diskriminativnu metodu za ispitivanje oslobađanja lijeka iz inovativnog in situ gelirajućeg pripravka za oftalmičku primjenu. Kao aparatura za ispitivanje oslobađanja in vitro odabrana je vertikalna difuzijska ćelija. Za potrebe rada pripremljene su i četiri formulacije s timolol maleatom koje se temelje na poloksamerima P407 i P188 kao pomoćnim tvarima koje određuju temperaturu geliranja te kitozanu koji poboljšava mehaničku čvrstoću nastalog gela. Kako bi se odabrao medij za ispitivanje brzine oslobađanja, ispitana je topljivost timolol maleata koristeći tri medija, simulirani suzni fluid, Krebs-Ringerov pufer i fosfatni pufer. Nije bilo značajne razlike u topljivosti timolol maleata u ispitivanim medijima, pa je kao medij odabran simulirani suzni fluid, zbog najbolje simulacije uvjeta in vivo. Za odabir membrane za ispitivanje brzine oslobađanja ispitana je adsorpcija timolola i otpor difuziji koristeći pet membrana koje su se razlikovale po svom sastavu i veličini pora. Optimalnom se pokazala membrana izrađena od celuloza acetata, veličine pora 0,8 μm. Kao analitička metoda korištena je ultravisoko-učinkovita tekućinska kromatografija. U sklopu validacije analitičke metode potvrđena je njena specifičnost, linearnost i točnost za timolol maleat u rasponu koncentracija od 0,5 μg/mL do 516,9 μg/mL. Za provjeru diskriminatornosti razvijene metode oslobađanja lijeka in vitro analizirane su četiri formulacije koje se razlikuju po količini pomoćnih tvari ili količini djelatne tvari. Provedene analize pokazale su da je razvijena metoda sposobna detektirati razlike u formulaciji, pa može biti koristan alat u razvoju formulacije inovativnog in situ gelirajućeg pripravka timolol maleata za oftalmičku primjenu.