| Abstract | Azatioprin je lijek, točnije prolijek, koji se pokazao kao učinkoviti imunosupresiv te se iz tog razloga često koristi u terapijama mnogih oboljenja kada se upravo nastoji smanjiti imunosni odgovor bolesnika. Budući da profil njegovih nuspojava među ostalim uključuje krvarenja, infekcije, razvoj limfoma i karcinoma kože, od iznimne je važnosti razviti analitičku metodu kojom se može odrediti njegova koncentracija u biološkim uzorcima s ciljem propisivanja optimalne doze pacijentima. Tim više, što je za enzim TPMT koji ovaj lijek metabolizira, pokazano da su u sveukupnoj populaciji od 11% ljudi prisutne mutacije alela tog genskog produkta, što znači da je kod takvih osoba indiciran ili prekid nastavka liječenja ili obavezno smanjenje doze kako bi se što više minimizirali njegovi toksični učinci. Cilj ovog diplomskog rada bio je razviti jedinstvenu metodu za određivanje azatioprina u tabletama i plazmi primjenom vezanog sustava tekućinske kromatografije i masene spektrometrije. Kako bi se osigurala pouzdanost mjerenja novorazvijenu metodu je bilo potrebno validirati. Tijekom postupka validacije metode ispitane su sljedeće
validacijske značajke: linearnost, granica dokazivanja, granica određivanja i ponovljivost. Linearnost metode je ispitana na 5 različitih koncentracija u rasponu od 0,02 do 0,6 μg/μl. Jednadžba regresijskog pravca iznosila je y = 7901,2 + 6,7969, dok je koeficijent korelacije (k) bio veći od 0,999 te je moguće utvrditi kako je postignuta izvanredna linearnost metode. LOD vrijednost dobivena iz omjera signal-šum iznosila je 0,0016 μg/ml, a za LOQ 0,0054 μg/ml. Niske vrijednosti LOD i LOQ upućuju na to da je metoda osjetljiva i stoga prikladna za analizu niskih koncentracija azatioprina u uzorcima. Ispitana je ponovljivost metode unutar istog dana te između dva različita dana primjenom otopine azatioprina (0,6 μg/ml). Budući da su dobivene iznimno niske RSD vrijednosti (manje od 0,36%) moguće je utvrditi kako je predložena HPLC/DAD/MS/MS metoda ponovljiva. Iz svega gore navedenog, proizlazi da bi se predložena metoda mogla primjenjivati u rutinskim kliničkim ispitivanjima. |
| Abstract (english) | Azathioprine is a medicine, more specifically a prodrug, which has proven to be an effective immunosuppressant, and is therefore often used in many disease therapies when it is trying to reduce the patient's immune response. Since the profile of its side effects among others includes bleeding, infections, lymphoma and skin cancer, it is of a great importance to develop an analytical method to determine its concentration in biological samples with the aim of prescribing optimal doses to patients. Moreover, in the total population of 11% of people there are present allele mutations of the gene coding for TPMT enzyme which metabolises azathioprine. That is why such persons are advised to discontinue treatment or to
reduce mandatory dose to minimize its toxic effects. The aim of this graduate thesis was to develop a unique method for the determination of azathioprine in tablets and plasma using a coupled system of liquid chromatography and mass spectrometry. To ensure the reliability of the measurement, the newly developed method needed to be validated. During the validation process the following validation features were examined: linearity, limit of detection, limit of quantitation and repeatability. The linearity method was tested at 5 different concentrations ranging from 0.02 to 0.6 μg / μl. The equation of the regression line was y = 7901.2 + 6.7969, while the coefficient of correlation (k) was greater than 0.999 which shows
the remarkable linearity of the method. The LOD value was obtained from a signal-to-noise ratio of 0.0016 μg / ml and for LOQ 0.0054 μg / ml. The low values of LOD and LOQ indicate that the method is sensitive and therefore suitable for low concentrations of azathioprine in the samples. The repeatability of the method was tested on the same day and between two different days using azathioprine solution (0.6 μg / ml). Since extremely low RSD values (less than 0.36%) were obtained, it is possible to conclude that proposed HPLC/DAD/MS/MS method is repeatable. From all of the above, it follows that the proposed method could be applied in routine clinical trials. |
