Obitelj MATH-BTB sastoji se od proteina koji sadrže dvije domene, MATH (Meprin and TRAF Homology) i BTB (Broad-complex, Tramtrack, and Bric-à-brac). U genomima gotovo svih eukariota, velik broj gena sadrži funkcionalni slijed koji kodira ili domenu MATH ili domenu BTB uz barem jednu drugu domenu. Proteini koji sadrže domenu BTB svrstani su u dvije glavne skupine: oni koji sudjeluju u proteinskim interakcijama posredovanim domenom BTB i oni koji vežu DNA kako bi regulirali transkripciju (Stogios i sur., 2005). Svi dosad istraženi proteini koji sadrže domenu MATH uključeni su u regulaciju obrade proteina (Zapata i sur., 2007). Proteini iz podskupine MATH-BTB, koji sadrže i MATH i BTB domenu, opisani su kao adapteri kompleksa ubikvitin ligaze E3 zasnovane na proteinu Cullin 3 (CUL3). Ovaj tip ligaze E3 (u daljnjem tekstu: ligaza CUL3-E3) sudjeluje u proteasomskoj razgradnji ciljnih proteina. Kompleks ligaze CUL3- E3 čini protein osovine CUL3 koji s jedne strane veže protein RING-BOX1 (RBX1) i preko njega ubikvitin ligazu E2, a s druge strane veže domenu BTB proteina adaptera. Protein adapter svojom domenom MATH veže ciljni protein, i time ga dovodi u neposrednu blizinu ligaze E2 koja ga obilježava poliubikvitinskim lancem i time ga usmjerava u razgradnju na proteasomu 26S (Chen i sur., 2013, Gingerich i sur., 2005, Juranić i sur., 2012, Stogios i sur., 2005., između ostalih). Najranije opisan životinjski protein iz obitelji MATH-BTB je protein MATERNAL EFFECT LETHAL-26 (MEL-26) iz oblića Caenorhabditis elegans. MEL-26 je adapter ligaze E3 koji posreduje u razgradnji proteina MEI-1, proteina iz skupine katanina s ulogom cijepanja mikrotubula. Ovaj proces odvija se nakon mejoze i ključan je za sastavljanje mitotičkog vretena (Pintard i sur., 2004). Proteini MATH-BTB široko su zastupljeni i u biljkama, no detaljno je proučeno samo nekoliko članova. Filogenetička analiza gena MATH-BTB u dvosupnici talijinom uročnjaku (Arabidopsis thaliana (L.) Heynh) i jednosupnici riži (Oryza sativa L.) pokazala je da geni MATH-BTB grupiraju u dvije skupine: manju, evolucijski očuvaniju osnovnu skupinu i veću, proširenu skupinu (Gingerich i sur., 2005). Uključivanje više kopnenih biljnih vrsta u filogenetičku analizu potvrdilo je razdvajanje biljnih gena MATH-BTB u dvije skupine, uz dodatno grupiranje gena iz proširene skupine u pet manjih podskupina, nazvanih E1 do E5 (Gingerich i sur., 2007; Juranić i Dresselhaus, 2014). Dok genom uročnjaka kodira samo šest gena MATH-BTB (AtBPM1- 6), koji grupiraju u osnovnu skupinu (Gingerich i sur. 2005; 2007; Juranić i Dresselhaus, 2014), evoluciju trava (porodica Poaceae) obilježila je velika ekspanzija gena MATH-BTB, koji specifično grupiraju u proširenu skupinu (Gingerich i sur., 2007; Juranić i Dresselhaus, 2014). Do sada je opisano nekoliko biljnih proteina MATH-BTB. Jedan od njih je protein ZmMAB1 kukuruza (Zea mays L.), protein iz proširene skupine eksprimiran u muškom i ženskom gametofitu (Juranić i sur., 2012). Istraživanje mutanata sa smanjenom ekspresijom gena ZmMAB1 pokazalo je da protein ZmMAB1 ima ulogu u pozicioniranju jezgara tijekom prijelaza iz mitoze u mejozu u muškom i ženskom gametofitu, kao i u formiranju i funkciji diobenog vretena tijekom mejoze (Juranić i sur., 2012). Proučena su i dva gena MATH-BTB pšenice (Triticum aestivum L.). Dok je TaMAB1 eksprimiran isključivo u jajnim stanicama pšenice, TaMAB2 je eksprimiran u zigoti i u dvostaničnom proembriju (Leljak-Levanić i sur., 2013). Prekomjerna ekspresija rekombinantnog proteina TaMAB2 obilježenog zelenim fluorescentnim proteinom (eng. green fluorescent protein, GFP) u stanicama duhana BY2, rezultirala je lokalizacijom proteina TaMAB2 u jezgri i oko nje (Leljak-Levanić i sur., 2013). Obitelj proteina MATH-BTB uročnjaka (nadalje BPM) detaljnije je proučena. Djelujući kao adapteri ligaza CUL3-E3 specifični za vezanje supstrata, proteini BPM posreduju u razgradnji različitih transkripcijskih faktora, te stoga djeluju kao regulatori različitih razvojnih procesa i odgovora na stres. Primjerice, proteini BPM povezani su s regulacijom odgovora na hormon abscizinsku kiselinu (ABA), ključnog mehanizma odgovora biljke na biotski i abiotski stres. Proteini BPM potiču razgradnju transkripcijskog faktora ATHB6 iz obitelji leucinskih zatvarača (eng. homeodomain-leucine zipper; HD-ZIP), koji koči signalni put hormona ABA (Himmelbach i sur., 2002). Proteini BPM, potičući njegovu razgradnju, promoviraju signalni put hormona ABA (Lechner i sur., 2011). Nadalje, proteini BPM3 i BPM5 potiču razgradnju protein fosfataza tipa 2C (PP2C), negativnih regulatora signalnog puta hormona ABA, čime reguliraju količinu raspoloživih proteina PP2C tijekom odgovora na stres (Julian i sur., 2019). Proteini BPM uključeni su i u regulaciju cvjetanja, potičući razgradnju transkripcijskog faktora MYB56 iz porodice R2R3-MYB, koji smanjuje ekspresiju gena FLOWERING LOCUS T (FT), ključnog aktivatora cvatnje u uročnjaku (Chen i sur., 2015). Proteini BPM također su povezani s reakcijom na etilen i to putem interakcije s transkripcijskim faktorima iz obitelji Apetala2/ethylene response factor (AP2/ERF). Primjerice, proteini BPM destabiliziraju transkripcijski faktor WRINKLED 1 (WRI1) te tako utječu na metabolizam masnih kiselina i razvoj sjemena u uročnjaku (Chen i sur., 2013). Nedavno je još jedan član obitelji AP2/ERF povezan s proteinima BPM, krovni transkripcijski faktor DEHYDRATION-RESPONSIVE ELEMENT BINDING 2A (DREB2A) uključen u odgovor na sušu i toplinski stres u uročnjaku. DREB2A potiče ekspresiju mnogih gena osjetljivih na sušu i toplinski stres, a i ekspresija gena DREB2A inducirana je stresom (Sakuma i sur., 2006a; 2006b). Proteini BPM stupaju u interakciju s DREB2A i potiču njegovu razgradnju putem aktivnosti CUL3-E3 ligaze, čime reguliraju količinu raspoloživog proteina DREB2A u uvjetima stresa (Morimoto i sur., 2017). Prvi cilj ovog rada bila je filogenetička analiza proteina MATH-BTB pšenice i uročnjaka. Radi dobivanja uvida u evolucijsku povijest proteina pšenice iz obitelji MATH-BTB, temeljem aminokiselinske sekvence proteina TaMAB2 pretražen je genom pšenice u bazi podataka Ensembl Plants. Ovom pretragom dobivena je lista od 46 gena MATH-BTB, anotiranih kao TaMAB1-46 u skladu s nomenklaturom predloženom za gene TaMAB1-2 (Triticum aestivum MATH-BTB; Leljak-Levanić et al., 2013). Aminokiselinske sekvence proteina TaMAB pretražene su u bazi podataka NCBI radi provjere prisutnosti evolucijski očuvanih domena MATH i BTB, prema bazama Protein family (Pfam) i Conserved Domains (CD). Za svih 46 proteina predviđeno je postojanje barem jedne domene MATH i jedne domene BTB, dok protein TaMAB46 sadrži po dvije kopije domena MATH i BTB. Ovaj rezultat ukazuje na veliku ekspanziju gena MATH-BTB pšenice, što je u skladu s postojećim podacima o ekspanziji obitelji MATH-BTB u drugim vrstama trava, kao što su riža, kukuruz, Sorghum bicolor i Brachypodium dystachion (Gingerich i sur., 2007; Juranić i Dresselhaus, 2014). Iz baze Ensembl Plants preuzeti su podaci o postojanju varijanti alternativnog prekrajanja RNA (eng. splicing variants) i broju egzona u kodirajućoj regiji. Dok većina gena TaMAB kodira za jednu RNA, četiri gena TaMAB kodiraju po dvije alternativne varijante prekrajanja. Najveći broj gena TaMAB sadrži jedan ili dva egzona, dok manji broj gena sadrži tri, četiri, pet ili, u jednom slučaju, osam egzona u kodirajućoj regiji. Nadalje, provedena je filogenetička analiza identificiranih proteina MATH-BTB pšenice, zajedno s proteinima MATH-BTB kukuruza (Juranić i sur., 2012), riže (Gingerich i sur., 2007.) i uročnjaka (Gingerich i sur., 2005; 2007). Metodom maksimalne vjerojatnosti utvrđeno je grupiranje proteina MATH-BTB u dvije skupine, osnovnu i proširenu, uz dodatno razdvajanje gena proširene skupine u pet podskupina, nazvanih E1 do E5, prateći nomenklaturu iz Juranić i Dresselhaus (2014). Dok je svih šest gena uročnjaka grupiralo u osnovnu skupinu, većina gena pšenice grupirala je u proširenu skupinu, što je u skladu s dosadašnjim saznanjima da je proširena skupina specifična za gene MATH-BTB trava (Juranić i Dresselhaus, 2014). Samo četiri proteina MATH-BTB pšenice grupirala su u osnovnu skupinu, i oni sadrže po četiri ili pet egzona, što je najčešći broj egzona gena BPM uročnjaka. Protein TaMAB2 grupirao je u podskupinu E3 proširene skupine. S ciljem provjere evolucijske očuvanosti domena MATH i BTB u osnovnoj i proširenoj skupini, iz baza Pfam i CD preuzete su sekvence navedenih domena svih proteina pšenice proširene skupine, kao i svih proteina pšenice, kukuruza, riže i uročnjaka iz osnovne skupine. Višestruko sravnjenje sljedova pokazalo je manju očuvanost domene MATH proširene skupine u odnosu na domenu BTB, dok je u osnovnoj skupini domena MATH očuvanija od domene BTB. Ovaj rezultat u skladu je s postojećim indicijama o pojačanoj diverzifikaciji domene MATH proširene skupine, za koju se smatra da je posljedica diverzifikacije supstrata proteina MATH-BTB kao adaptera CUL3-E3 ligaze (Gingerich i sur., 2007) te je vezana uz okolišne čimbenike koji su specifično oblikovali obitelj MATH-BTB vrsta iz porodice trava (Juranić i Dresselhaus, 2014). Drugi cilj ovog rada bio je istražiti funkcije dvaju predstavnika obitelji MATH-BTB, proteina pšenice iz proširene skupine, TaMAB2, i proteina uročnjaka iz osnovne skupine, AtBPM1 (nadalje BPM1). Budući da utišavanje gena TaMAB2 u pšenici dovodi do letalnog fenotipa (Bauer i sur., 2019), za istraživanje fizioloških uloga proteina TaMAB2 nije bilo moguće koristiti homologni sustav. Stoga je za indirektno istraživanje funkcije proteina TaMAB2 korištena stabilna transgenična linija uročnjaka koja eksprimira protein TaMAB2 obilježen privjeskom GFP (TaMAB-GFP; Bauer i sur., 2019). Na sličan način, za istraživanje proteina BPM1, korištena je transgenična linija uročnjaka koja prekomjerno eksprimira BPM1-GFP. Oba gena stabilno su integrirana u genom i pod kontrolom su promotora virusa mozaika cvjetače 35S (eng. cauliflower mosaic virus, CaMV 35S), osiguravajući konstitutivnu ekspresiju fuzijskog proteina. Prethodna istraživanja ukazala su na uloge proteina MEL-26 i ZmMAB1 kao adaptera ligaze CUL3-E3, u sklopu koje usmjeravaju ciljne proteine na razgradnju i tako sudjeluju u regulaciji citoskeleta. Kako bi se provjerila potencijalna povezanost proteina TaMAB2 i regulacije funkcije citoskeleta, provedena je analiza produžnog rasta korijena klijanaca uročnjaka s prekomjernom ekspresijom TaMAB2. Duljina primarnog korijena transgeničnih klijanaca bila je ista kao kod divljeg tipa, no duljina epidermalnih stanica korijena bila je statistički značajno veća kod transgenične linije u odnosu na divlji tip, ukazujući na potencijalnu ulogu proteina TaMAB2 u regulaciji funkcije citoskeleta. Nadalje, transgenični protoplasti s prekomjernom ekspresijom proteina TaMAB2 analizirani su metodom Duolink te je utvrđena kolokalizacija proteina TaMAB2 s ubikvitinom u citoplazmatskim nakupinama, ukazujući na moguću uključenost proteina TaMAB2 u sastav ligaze CUL3-E3 ovisne o ubikvitinu. Ovi rezultati u skladu su s ranije pokazanom lokalizacijom proteina TaMAB2 u citoplazmi i jezgri (Leljak-Levanić i sur., 2013) te zabilježenom interakcijom između TaMAB2 i CUL3 (Bauer i sur., 2019). Sustavom dvaju kvaščevih hibrida (eng. yeast two hybrid, Y2H) provjerena je interakcija između proteina TaMAB2 i citoskeletnog regulatora Katanina iz pšenice, no zbog nespecifične interakcije u negativnoj kontroli, direktna interakcija s Kataninom nije potvrđena. Koristeći transgeničnu liniju uročnjaka koja prekomjerno eksprimira TaMAB2 prethodno je proveden eksperiment uzastopne afinitetne kromatografije i spektrometrije masa (eng. tandem affinity purification-mass spectrometry, TAP-MS), te su otkriveni potencijalni interaktori proteina TaMAB2, između ostalih, podjedinica A faktora inicijacije translacije 4 i podjedinica G faktora inicijacije translacije 3 (Bauer i sur., 2019). Oba proteina analizirana su u sustavu Y2H, no interakcija s proteinom TaMAB2 nije potvrđena. Dosadašnja istraživanja opetovano su ukazivala na funkciju proteina BPM uročnjaka u odgovoru na stres. S ciljem daljnje analize uloge proteina BPM1 u promijenjenim okolišnim uvjetima, biljke divljeg tipa uročnjaka i/ili transgenične linije koje prekomjerno eksprimiraju protein BPM1 izložene su uvjetima suše, solnog stresa, povišenoj temperaturi te različitim uvjetima osvjetljenja, te su potom analizirane različitim metodama. U divljem tipu je kvantitativnom metodom reverzne transkripcije i lančane reakcije polimeraze (eng. quantitative reverse transcription polymerase chain reaction, RT-qPCR) mjerena ekspresija svih šest gena BPM, dok je u transgeničnim linijama hibridizacijom po Westernu mjerena stabilnost fuzijskog proteina BPM1-GFP, dok je njegova unutarstanična lokalizacija analizirana fluorescencijskom mikroskopijom. U svrhu induciranja solnog stresa, osmotskog stresa i signalne kaskade hormona ABA, biljke su tretirane natrijevim kloridom, manitolom odnosno hormonom ABA. U divljem tipu, ovi tretmani nisu uzrokovali značajnu promjenu u ekspresiji gena BPM, osim u slučaju gena BPM5, čija se ekspresija smanjila nakon tretmana manitolom, i gena BPM6, čija je ekspresija porasla nakon tretmana natrijevim kloridom. U transgeničnim linijama, razina proteina BPM1 nije se promijenila nakon izlaganja osmotskom stresu i hormonu ABA, dok je tretman solnim stresom smanjio količinu proteina BPM1, najvjerojatnije putem proteasomske degradacije. Nadalje, dok su osmotski stres i ABA inducirali snažnu akumulaciju proteina BPM1 u jezgri stanica korijena, solni stres je uzrokovao difuziju signala proteina BPM1 duž stele korijena. Osim toga, proveden je test klijavosti divljeg tipa i transgeničnih linija na hranjivim podlogama s dodatkom natrijevog klorida, manitola i hormona ABA. Test je pokazao da su transgenične linije otpornije od divljeg tipa na osmotski stres i stres uzrokovan hormonom ABA. S druge strane, transgenične linije bile su jednako podložne solnom stresu kao i divlji tip uročnjaka. Ovi rezultati ukazuju na potencijalnu ulogu proteina BPM1 u odgovoru na sušu, no ne i na solni stres, pri čemu bi nakupljanje proteina u jezgri i stabilna količina raspoloživog proteina mogle imati značajnu ulogu. Radi provjere učinka povišene temperature na ekspresiju gena BPM te stabilnost i lokalizaciju proteina BPM1, klijanci su inkubirani na 37 °C. U divljem tipu je nakon 3 sata tretmana zabilježen porast ekspresije gena BPM1, BPM2 i BPM3, s najvećim povećanjem izmjerenim za gen BPM2. Ekspresija gena BPM4 bila je blago smanjena, a gena BPM5 i BPM6 nepromijenjena. Nadalje, količina proteina BPM1 značajno je porasla nakon 1 sat i 3 sata tretmana povišenom temperaturom, a analiza korijena klijanaca ukazala je na njegovu snažnu akumulaciju u jezgrama epidermalnih stanica nakon 6 sati tretmana. Ovi rezultati ukazuju da su u uvjetima povišene temperature, proteini BPM, osim na razini genske ekspresije, regulirani i na post-translacijskoj razini, odnosno na razini stabilnosti proteina. Porast genske ekspresije u divljem tipu te stabilizacija proteina u transgeničnoj liniji ukazuju na nužnost povećane i stabilne razine raspoloživog proteina BPM1 u uvjetima povišene temperature, što je u skladu s opisanom ulogom proteina BPM kao regulatora količine transkripcijskog faktora DREB2A u sklopu odgovora na toplinski stres, radi sprječavanja mogućih negativnih posljedica nakupljanja DREB2A (Morimoto i sur., 2017). S ciljem provjere učinka prekomjerne ekspresije proteina BPM1 na količinu transkripcijskog faktora DREB2A, napravljena je indirektna analiza ekspresije gena HsfA3 i AT4G36010, čiju ekspresiju inducira DREB2A u uvjetima toplinskog stresa (Sakuma i sur., 2006b). Dok je u divljem tipu uročnjaka izlaganje povišenoj temperaturi uzrokovalo očekivan porast ekspresije gena HsfA3 i AT4G36010, u transgeničnim linijama s prekomjernom ekspresijom proteina BPM1 taj je porast bio značajno manji, ukazujući na smanjenu količinu aktivnog transkripcijskog aktivatora DREB2A. Ovaj rezultat dodatno potvrđuje ulogu proteina BPM1 u degradaciji transkripcijskog faktora DREB2A. Za gen BPM2 zabilježen je najveći porast ekspresije u divljem tipu nakon izlaganja povišenoj temperaturi. Gen BPM2 ujedno ima i najveći broj varijanti alternativnog prekrajanja RNA, koje mogu dati pet različitih proteinskih produkata (BPM2.1 – BPM2.5). S ciljem provjere učinka povišene i snižene temperature na alternativno prekrajanje gena BPM2, klijanci divljeg tipa uročnjaka izloženi su 3 sata temperaturama 37 °C odnosno 4 °C te je metodom RT-qPCR mjerena količina triju transkripata gena BPM2, točnije BPM2.3, BPM2.4 i BPM2.5. Dobiveni rezultati ukazali su da je količina transkripta BPM2.5 značajno porasla nakon oba tretmana, ukazujući na dominantnu ulogu ove proteinske varijante u oba tipa temperaturnog stresa. Nadalje, povišena temperatura povećala je količinu transkripta BPM2.3, a smanjila količinu transkripta BPM2.4, dok snižena temperatura nije imala značajnog utjecaja na količine ovih transkripata. Ovi rezultati ukazuju na dodatnu razinu regulacije aktivnosti proteina BPM uslijed temperaturnog stresa, uz regulaciju genske ekspresije i stabilnosti proteina, što potencijalno omogućava raznolikiji odgovor biljaka na stres. Osim toga, varijanta BPM2.3, čija se količina povećava na povišenoj temperaturi, ne sadrži potpunu domenu BTB, čime se otvara mogućnost dodatnih uloga proteina BPM u odgovoru na stres, koje ne zahtijevaju interakciju s proteinom CUL3 posredovanu domenom BTB. Količina svjetlosti je, kao i temperatura i količina dostupne vode, okolišni čimbenik koji oscilira s obzirom na doba dana ili godine. S ciljem provjere učinka fotoperioda na ekspresiju gena BPM, klijanci divljeg tipa uzgajani su u uvjetima dugog dana te su uzorkovani tijekom dana: u 12:00 i 17:00 te u 6:00 (kraj noćnog perioda). Ekspresija je analizirana metodom RT-qPCR. Za gene BPM2 i BPM6 pokazan je statistički značajan porast ekspresije na kraju noćnog perioda (6:00) u odnosu na 12:00 i 17:00, dok je kod ostalih gena zabilježen sličan trend, ali bez statističke značajnosti. Nadalje, klijanci transgenične linije uzorkovani su svaka 4 sata tijekom perioda od 24 sata i količina proteina BPM1 analizirana je imunodetekcijom. Rezultati ove analize pokazali su da se količina proteina BPM1 značajno smanjuje tijekom noći, ukazujući na smanjenu stabilnost i degradaciju proteina. Konačno, s ciljem provjere unutarstanične lokalizacije proteina BPM1 nakon dugotrajnog izlaganja svjetlosti odnosno mraku, klijanci transgenične linije analizirani su fluorescencijskom mikroskopijom. Dok je produljeno izlaganje svjetlosti uzrokovalo karakteristično nakupljanje proteina BPM1 u jezgrama epidermalnih stanica korijena, inkubacija u mraku dovela je do disperzije signala proteina BPM1 te naposljetku do translokacije u stelu korijena. Ovi rezultati ukazuju na regulaciju stabilnosti i unutarstanične lokalizacije proteina BPM1 ovisnu o fotoperiodu, što je u skladu s ranijim indikacijama o ulozi proteina BPM u regulaciji cvjetanja, gdje fotoperiod ima važnu ulogu (Chen i sur., 2015; Škiljaica i sur., 2020.) S obzirom na utjecaj povišene temperature na ekspresiju gena iz obitelji BPM, posljednji cilj ovog rada bio je odabir i validacija referentnih gena za normalizaciju vrijednosti ekspresije u metodi RTqPCR, u tkivima uročnjaka izloženima povišenoj temperaturi. Pregledom literature i javno dostupnih pokusa DNA mikročipova (eng. microarray) na tkivima uročnjaka izloženima raznim toplinskim tretmanima, odabrano je deset referentnih gena kandidata. Klijanci divljeg tipa uročnjaka i odrasle biljke u fazi cvatnje tretirane su s pet različitih povišenih temperatura nakon čega su uzorkovani čitavi klijanci, komadići listova i cvjetni pupovi. Ekspresija referentnih gena kandidata mjerena je metodom RT-qPCR, nakon čega je stabilnost ekspresije analizirana pomoću četiri različita programa za validaciju referentnih gena. U konačnici je provedena empirijska validacija najstabilnijih gena u eksperimentu gdje je kao testni gen korišten DREB2A, a različite kombinacije referentnih gena korištene su za normalizaciju podataka. Za svaku vrstu tkiva predloženi su optimalni referentni geni za uporabu u analizama diferencijalne ekspresije gena uročnjaka izloženog povišenim temperaturama.