| Abstract | In this thesis, I present results of my work over the last three years, carried out as a member of Pavin Group at the Faculty of Science, University of Zagreb. The mitotic spindle is a complex micro-machine composed of microtubules and associated proteins that must be highly ordered in space and time to function properly. A functional spindle has a distinct shape composed of curved bundles of microtubules twisted around the pole-to-pole axis. There is still a lack of understanding of how linear and rotational forces define the overall shape of the mitotic spindle, as well as how twisted shapes emerge as a result of interactions between microtubules and motor proteins. To answer this, we use a mean-field approach to model the entire spindle, describing the forces and torques along microtubule bundles throughout the spindle. We compare our theoretical modelling to experimentally observed bundle shapes in the mitotic spindle, including both unperturbed and compressed spindles. We conclude that rotational forces are primarily responsible for the observed spindle shape. Furthermore, we discover that the difference in bending forces explains the difference in the shapes of the inner and outer bundles, that the chirality of the spindle is caused by a constant twisting moment and that there exists a preferred direction from microtubules arising out of the centrosome. |
| Abstract (croatian) | Diobeno vreteno je stanična struktura koja je odgovorna za raspodjelu genetskog materijala medu stanicama kćeri, a sastoji se od mikrotubula i pridruženih proteina. Funkcionalno diobeno vreteno ima karakterističan oblik, sastojeći se od zakrivljenih svežnjeva mikrotubula, zakrenutih oko osi vretena. Potpuno razumijevanje linearnih i rotacionih sila, koje određuju cjelokupni oblik diobenog vretena te koje interakcije između mikrotubula i motornih proteina ih stvaraju, ostaje otvoreno pitanje. Predstavljamo metodu kojom je moguće izvući relevantne geometrijske parametre iz mikroskopskih slika diobenog vretena. Nadalje, uvodimo teorijski model diobenog vretena u kojem motorni proteini stvaraju sile i momente sila na polovima i duž svežnjeva mikrotubula, time regulirajući oblike svežnjeva mikrotubula. Iz modela dobivamo predviđanje oblika diobenog vretena, odnosno raspodjelu sila u diobenom vretenu, iz kojih možemo zaključiti da razlika u silama savijanja objašnjava razliku u obliku unutarnjih i vanjskih mikrotubula te da je cjelokupni oblik vretena većinski rezultat rotacionih sila. U prvom poglavlju opisana je struktura diobenog vretena, kao i njegova svojstva i uloga. Predstavljen je detaljni pregled biološke grade diobenog vretena i njegove strukture te je uloga diobenog vretena u staničnoj diobi i u stanici razjašnjena. Struktura diobenog vretena je razrađena sa posebnim naglaskom na svežnjeve mikrotubula i motornih proteina, koji svojim djelovanjem stvaraju sile i momente sila u diobenom vretenu. Uvedena je fizikalna teorija elastičnosti, s istaknutim dijelovima koji se koriste u radu za opis svežnjeva mikrotubula te je objašnjena opravdanost korištenja iste za opis stvarnih svežnjeva mikrotubula. Drugo poglavlje posvećeno je kiralnosti diobenog vretena, odnosno opisano je nedavno otkriće da se svežnjevi mikrotubula u diobenom vretenu namotavaju oko glavne osi diobenog vretena, tj. da nisu isključivo ravninski oblici. Objašnjena je pojava zavrnutih mikrotubula u diobenom vretenu, značaj tog uvrnuća za razumijevanje ravnoteže sila i momenata sila u diobenom vretenu te dosadašnji (neuspjeli) pokušaji kvantificiranja ovog uvinuća. Navedeno ujedno služi i kao uvod za opis glavnog cilja radnje, koji uključuje konstrukciju sveobuhvatnog modela diobenog vretena, koristeći aprokismaciju srednjeg polja, te prethodnu potrebu razvijanja metode koja će moći adekvatno izmjeriti uvrnuće svežnjeva mikrotubula u diobenom vretenu, kako bi se eksperimentalni podaci mogli dobro interpretirati te služiti za postavljanje, a potom i verifikaciju modela. U trećem poglavlju razvija se metoda kosog kruga (eng. Oblique Circle Method) koja se koristi služi za mjerenje uvinutosti mikrotubula. Prikazane su pretpostavke metode, ista je sistematički razrađena te u konačnici primijenjena i validirana na stvarnim ljudskim stanicama. Metoda je potom korištena za dobivanje zaključaka o strukturi diobenog vretena u perturbiranim i ne-perturbiranim ljudskim tumorskim stanicama, kao i stanicama amebe. Iz primjene metode dobiveni su zaključci o okomitim i paralelnim silama i momentima sila u diobenom vretenu. U četvrtom poglavlju uvodi se fizikalni model diobenog vretena, koji za cilj ima opis svih svežnjeva mikrotubula u metafaznom diobenom vretenu. Predstavljen je opis sustava od prebrojivo mnogo svežnjeva mikrotubula te je potom aproksimacijom srednjeg polja taj broj pušten u beskonačnost, kako bi se dobio kontinuirani model koji opisuje cjelokupno diobeno vreteno. Iz kontinuiranog modela je izračunata ravnoteža sila i momenata sila u čitavom diobenom vretenu nakon čega su svežnjevi mikrotubula opisani Kirchhoffovom jednadžbom za tanke štapove. Predstavljeni su ulazni i izlazni parametri modela, istražen je parametarski prostor modela te je biološki relevantan dio parametarskog prostora identificiran. U petom poglavlju je teorijski model uspoređen s eksperimentalnim podacima bioloških diobenih vretena, koristeći za usporedbu informacije dobivene uporabom metode kosog kruga na mikroskopske slike diobenog vretena. Teorijski model je uspoređen s više staničnih linija te su za svaku staničnu liniju pronađeni parametri koji ju najbolje opisuju, odnosno, određene su optimalne distribucije sila i momenata sila u diobenom vretenu. Iz distribucije sila i momenata sile, pokazano je da unutarnji i vanjski mikrotubuli imaju znatno različite okomite sile, no slične paralelne sile. Nadalje, model pokazuje da mikrotubuli iz centrosoma izviru pod kutom, odnosno ne ravno poput zraka sunca, već su sve okrenute prema jednoj strani, što je dosad u polju nerazmatran detalj, ali za njega postoje eksperimentalni dokazi, stoga na taj način model sugerira daljnje eksperimente. U šestom poglavlju su reiterirani glavni zaključci doktorskog rada, u vidu rezultata koji su dobiveni korištenjem samo metode kosog kruga, ali i teorijskog modela, te njegove usporedbe s eksperimentalnim podacima. |
