prikaz prve stranice dokumenta Izrada modularnog sustava CRISPR/dCas9 upotrebom ortolognih proteina Cas9 i njegova primjena u epigenetičkim manipulacijama genskih lokusa
  Download
PDF 3.02 MB
doctoral thesis
Izrada modularnog sustava CRISPR/dCas9 upotrebom ortolognih proteina Cas9 i njegova primjena u epigenetičkim manipulacijama genskih lokusa
Zagreb: University of Zagreb, Faculty of Science, 2021. urn:nbn:hr:217:756265
Josipović, Goran
University of Zagreb
Faculty of Science
Department of Biology

Institutional repository: Repository of the Faculty of Science

Cite this document

Josipović, G. (2021). Izrada modularnog sustava CRISPR/dCas9 upotrebom ortolognih proteina Cas9 i njegova primjena u epigenetičkim manipulacijama genskih lokusa (Doctoral thesis). Zagreb: University of Zagreb, Faculty of Science. Retrieved from https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:217:756265

Josipović, Goran. "Izrada modularnog sustava CRISPR/dCas9 upotrebom ortolognih proteina Cas9 i njegova primjena u epigenetičkim manipulacijama genskih lokusa." Doctoral thesis, University of Zagreb, Faculty of Science, 2021. https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:217:756265

Josipović, Goran. "Izrada modularnog sustava CRISPR/dCas9 upotrebom ortolognih proteina Cas9 i njegova primjena u epigenetičkim manipulacijama genskih lokusa." Doctoral thesis, University of Zagreb, Faculty of Science, 2021. https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:217:756265

Josipović, G. (2021). 'Izrada modularnog sustava CRISPR/dCas9 upotrebom ortolognih proteina Cas9 i njegova primjena u epigenetičkim manipulacijama genskih lokusa', Doctoral thesis, University of Zagreb, Faculty of Science, accessed 15 May 2024, https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:217:756265

Josipović G. Izrada modularnog sustava CRISPR/dCas9 upotrebom ortolognih proteina Cas9 i njegova primjena u epigenetičkim manipulacijama genskih lokusa [Doctoral thesis]. Zagreb: University of Zagreb, Faculty of Science; 2021 [cited 2024 May 15] Available at: https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:217:756265

G. Josipović, "Izrada modularnog sustava CRISPR/dCas9 upotrebom ortolognih proteina Cas9 i njegova primjena u epigenetičkim manipulacijama genskih lokusa", Doctoral thesis, University of Zagreb, Faculty of Science, Zagreb, 2021. Available at: https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:217:756265

Metadata
TitleIzrada modularnog sustava CRISPR/dCas9 upotrebom ortolognih proteina Cas9 i njegova primjena u epigenetičkim manipulacijama genskih lokusa
Title (english)design of CRISPR/dCas9 modular system using orthogonal Cas9 proteins and its application in epigenetic manipulation of gene loci
AuthorGoran Josipović
MentorVlatka Zoldoš (mentor)
Committee memberAleksandar Vojta (predsjednik povjerenstva)
Committee memberMirjana Pavlica (član povjerenstva)
Committee memberSrećko Gajović (član povjerenstva)
GranterUniversity of Zagreb
Faculty of Science
(Department of Biology)
Zagreb
Defense date and country2021-05-25, Croatia
Scientific / art field,
discipline and subdiscipline		NATURAL SCIENCES
Biology
Universal decimal classification
(UDC)		577 - Biochemistry. Molecular biology. Biophysics
Abstract
Otkrivanje uzročno posljedičnih veza između epigenetičkih oznaka u kromatinu i regulacije ekspresije gena omogućeno je primjenom molekularnih alata koji mogu ciljano mijenjati epigenom. U ovom istraživanju izradio sam modularni sustav temeljen na CRISPR/dCas9 metodologiji za ciljanu epigenetičku manipulaciju i direktnu regulaciju ekspresije gena, sastavljen od glavnih modula: promotora RNA polimeraze II, ortologa dCas9, efektorske domene, selekcijskog biljega, te modula za primanje više molekula sgRNA potrebnih za navođenje konstrukta na ciljno mjesto u genomu. Ciljanjem parova genskih lokusa BACH2- HNF1A i IL6ST-MGAT3 s fuzijama antagonističkog djelovanja (metilacija vs. demetilacija DNA), uz korištenje dva ortologa dSpCas9 i dSaCas9 u stanicama HEK293, pokazao sam da je moguće promijeniti stupanj metilacije DNA kojeg prati promjena u ekspresiji tih gena. Također sam pokazao da epigenetičkom manipulacijom para gena MGAT3-HNF1A, u stanicama BG1, mogu promijeniti glikanski fenotip. Istovremenim korištenjem fuzijskih konstrukata TET1-dSaCas9 i VPR-dSpCas9 postigao sam sinergistički učinak na ekspresiju gena HNF1A koji je postojan kroz duži vremenski period. Dodatno sam unaprijedio modularni sustav u svrhu smanjenja nespecifičnog učinka.
Abstract (english)
Establishing a causal relationship between epigenetic marks in chromatin and the regulation of gene expression is made possible by the use of molecular tools that can specifically alter the epigenome. In this study, I developed a modular system based on the CRISPR/dCas9 methodology for targeted epigenetic manipulation and direct regulation of gene expression, consisting of major modules: RNA polymerase II promoter, dCas9 ortholog, effector domain, selection marker and module that can receive multiple sgRNA molecules to guide the construct in the genome. By targeting BACH2-HNF1A and IL6ST-MGAT3 gene pairs with fusions showing antagonistic functionalities (DNA methylation vs. demethylation), using two orthologs dSpCas9 and dSaCas9 in HEK293 cells, I showed that it is possible to change the DNA methylation accompanied by a change in gene expression. I also showed that by epigenetic manipulation of MGAT3-HNF1A gene pair, in BG1 cells, the glycan phenotype can be altered. By simultaneously using the fusion constructs TET1-dSaCas9 and VPR-dSpCas9, I achieved a synergistic effect on HNF1A gene expression that is stable over a longer period of time. I further improved the modular system in order to reduce the off-target effect.
Keywords
Keywords (english)
Languagecroatian
URN:NBNurn:nbn:hr:217:756265
Promotion2021
Study programmeTitle: Biology
Study programme type: university
Study level: postgraduate
Academic / professional title: doktor/doktorica znanosti, područje prirodnih znanosti, polje biologija (doktor/doktorica znanosti, područje prirodnih znanosti, polje biologija)
Type of resourceText
File originBorn digital
Access conditionsOpen access
Terms of useLicence In copyright icon
Created on2021-07-14 12:23:50