UVOD Egzosomi su membranske vezikule endocitnog podrijetla, koje se smatraju važnim čimbenicima u međustaničnoj komunikaciji. Mlijeko je vrlo složenog sastava koji osigurava adekvatnu prehranu, prijenos imuniteta i potiče adekvatan razvoj odojka. Smatra se da egzosomi mlijeka imaju ključnu ulogu u tim procesima, ali ih tek treba dodatno istražiti, kao i prijenosne mehanizme u kojima sudjeluju egzosomi u različitim fazama laktacije, te njihovu ulogu koja je važna je za razumijevanje različitih čimbenika tijekom laktacije, kao i za poboljšanje mliječnih nadomjestaka za ljude i životinje. Proteom i lipidom izvanstaničnih vezikula (EV) sadrži proteinske sastojke i različite druge aktivne tvari; promjene u tim odjeljcima mogle bi utjecati na njihovu ulogu u komunikaciji između stanica. Poznato je da omjer ω-6 i ω-3 višestruko nezasićenih masnih kiselina (PUFA) u prehrani utječe na zdravlje i upalu te izaziva promjene u sastavu masnih kiselina u mlijeku, ali do sada nijedno istraživanje nije uključivalo frakciju EV u mlijeku. Cilj ovog istraživanja bio je istražiti kako se mijenja sastav egzosoma mlijeka tijekom prijelaza s kolostruma u fazu odbića odojaka, te kako dva različita omjera ω-6 i ω-3 mliječnih kiselina utječu na lipidom i proteom egzosoma mlijeka i kolostruma krmača. MATERIJALI I METODE Šesnaest krmača, plotkinja koje su se više puta prasile, te su nasumično raspoređene u dva dijetalna tretmana: kontrolna skupina (Skupina S - GS) primala je standardnu prehranu s omjerom ω-6:ω-3 od 13:1 od 28. dana gravidnosti do prasenja, te u omjeru od 10:1 tijekom laktacije); a druga (tretirana) skupina (Grupa L - GL) hranjena je obrokom s niskim omjerom ω-6:ω-3 (4:1 od 28. dana gravidnosti do kraja laktacije, tj. 24 dana nakon prasenja). Uzorci mlijeka prikupljeni su 0, 7 i 14 dana nakon partusa tijekom prirodnog izlučivanja mlijeka, zamrznuti odmah nakon prikupljanja i čuvani na -80 °C do izolacije egzosoma. Egzosomi su izolirani ultracentrifugiranjem u kombinaciji s kromatografijom isključenja po veličini čestica (SEC), karakterizirani analizom praćenja nanočestica (NTA) pomoću NanoSight NS300 instrumenta, zatim transmisijskom elektronskom mikroskopijom (TEM) i metodom Western blot. Izolirani egzosomi pripremljeni su za digestiju u gelu, zatim za obilježavanje peptida izobarnim privjescima (TMT) te analizirani pomoću spektrometra masa spregnutog s tekućinskom kromatografijom (LC-MS/MS). Statističke analize podataka na razini podudaranja peptidnog spektra (PSM) provedene su u ‘’R’’ programu, verzija 3.6 , korištenjem ,,in house’’ razvijenog protokola. Analiza genske ontologije (GO) i analiza bioloških puteva provedeni su u STRING softverskoj verziji 11.0 i Cytoscapeu v3.8.2. pomoću ClueGO aplikacije. Lipidi su ekstrahirani Folch metodom, a lipidom izoliranih egzosoma određen je LCMS/MS spektrometrijom masa. Analiza podataka o lipidima provedena je u MS-DIAL programu primjenom baze podataka LipidBlast, a statistička analiza provedena je na programu MetaboAnalyst 5.0 (http://www.metaboanalyst.ca). REZULTATI I RASPRAVA Egzosomi mlijeka krmača karakterizirani su analizom praćenja nanočestica, transmisijskim elektronskim mikroskopom i metodom Western blot. Promjene u hranidbi i odnos između vremena i tretmana nisu dali razlike u veličini EV, dok su različite faze laktacije (kolostrum naspram mlijeka) dale razlike. Prosječni EV promjer nije se razlikovao (p = 0,6) između dvije skupine (GL = 151 ± 18,5; GS = 154 ± 19,3; (± SD u nm), za izolaciju korištenu u proteomskoj analizi; i GL = 162 ± 14,7 GS = 156 ± 20,6 , za izolaciju korištenu u analizi lipida). Populacija egzosoma bila je nešto manja u kolostrumu (139 ± 19 nm u izolaciji korištenoj u analizi proteoma; i 147 ± 21,3 u izolaciji korištenoj u analizi lipida) od mlijeka (162 ± 12,5 u izolaciji primijenjenoj u proteomskoj analizi; i 162 ± 18 u izolaciji koja se koristi u analizi lipida). Ispitivanje TEM metodom pokazalo je okrugle i poput čaše, konkavne sfere s morfologijom kompatibilnom s egzosomima. TSG101, proteinski marker egzosoma, detektiran Western blot metodom, bio je prisutan u mlijeku i egzosomima kolostruma u obje skupine. Rezultati analize metodom spektrometrije masa (LC-MS/MS) također su mapirani prema bazi podataka ExoCarta za oznake egzosoma, a svih 10 najboljih markera bilo je prisutno u uzorcima. LC-MS/MS analiza mapirala je 3989 peptida koji predstavljaju 637 proteina. Nakon što su primijenjeni kriteriji isključenja (FDR ≤ 0,5% i najmanje dva jedinstvena peptida, uklanjanje suvišnih peptidno-spektralnih podudaranja, single-shot proteina i peptida s visokom interferencijom izolacije), ukupno je 319 proteina u svakoj vremenskoj točki korišteno za statističku analizu. Kvantitativna proteomska analiza otkrila je različite profile proteoma za egzosome kolostruma i egzosome mlijeka. Egzosomi iz kolostruma imali su 162 različito zastupljena proteina (DAP) (82 povećana i 80 smanjena) u usporedbi s egzosomima iz mlijeka 7. dana, a 170 DAP (81 povećan i 89 smanjen) iz mlijeka 14. dana. Varijacije u proteomu unutar skupina s različitom hranidbom ustanovljene su 7. dana, s razlikama u zastupljenosti proteina spondina-2 i glukozom regulirani protein molekularne težine 78 kDa. Nisu pronađene razlike u egzosomima kolostruma između promatranih skupina. Proteini s funkcijama u razvoju imunološkog odgovora, regulaciji staničnih procesa i staničnom razvoju različito su eksprimirani između kolostruma i egzosoma mlijeka. Funkcionalna analiza istaknula je povećano eksprimirane biološke puteve povezane s regulacijom homeostaze u egzosomima kolostruma, te povećano eksprimirane biološke puteve kao što su razvoj endotelnih stanica i metabolizam lipida u egzosomima mlijeka. Funkcionalna analiza različito eksprimiranih proteina između promatranih skupina istaknula je molekule važne za vezikulom posredovani transport (GO:0016192) i transport (GO:0006810), koji bi mogao biti pod utjecajem promjena u sastavu PUFA. Lipidomska analiza primjenom spektrometrije masa uspjela je identificirati ukupno 947 lipida u uzorcima egzosoma mlijeka i kolostruma. Identificirani lipidi uključivali su 25 glavnih klasa i 47 potklasa lipida. Najzastupljenije klase lipida bili su diradilgliceroli, triradilgliceroli i fosfosfingolipidi, koji se sastoje od sfingolipida, uglavnom sfingomijelina, koji uključuju fosforne skupine. U usporedbi s egzosomima kolostruma, identificirali smo 734 različito zastupljena lipida u egzosomima mlijeka 7. dana i 779 DAL 14. dana. U usporedbi s egzosomima iz mlijeka 7. dana, egzosomi kolostruma imali su niži diacilglicerol (DG) (n = 176), triacilglicerol (TG) (n = 70), fosfatidilkolin (PC) (n = 62), sfingomijelin (SM) (n = 50), masne kiseline (FA9 (n = 48) i fosfatidiletanolamin (PE) (n = 48), a za razliku između dana 0 i dana 14, egzosomi kolostruma imali su niži DG ( n = 193), TG (n = 81), PC (n = 61), Cer (n = 61), PE (n = 60), SM (n = 58) i FA (n = 48). Nisu uočene značajne razlike u lipidnom sastavu egzosoma mlijeka između 7. i 14. dana, a uglavnom nema razlika u sastavu lipida između tretmana s različitim omjerima hranjenja ω-6 i ω-3 masnih kiselina. Samo jedan lipid (PA 17:0_28:6) bio je smanjen u usporedbi između egzosoma mlijeka iz GS i GL 14. dana. Rezultati otkrivaju specifičan profil lipida u egzosomima mlijeka krmača u različitim fazama laktacije, s mogućim implikacijama na njihovu funkcionalnu biologiju, uključujući razvoj strategija koje koriste upotrebu mliječnih egzosoma kao nosača za isporuku lijekova ili aditiva. ZAKLJUČCI Ova studija potvrđuje važnost egzosoma kao aktivnih biokomponenti mlijeka i daje nove temelje za buduća istraživanja uloge egzosoma u regulaciji imuniteta i razvoju odojaka. Identificirani funkcionalni proteom i dobivene mreže interakcija među proteinima u našoj studiji pomažu razjasniti ulogu egzosoma mlijeka u različitim razdobljima laktacije. Buduće studije istražit će daljnje učinke prehrane na sastav izvanstaničnih vezikula (EV) u mlijeku i njihov odnos prema razvoju mladunčadi. Karakterizacija lipida pruža znanja o strukturi, funkciji i stabilnosti egzosoma mlijeka. Dobiveni rezultati su relevantni za osnovno razumijevanje njihovog utjecaja na razvoj odojka, ali i za strategije koje uključuju upotrebu egzosoma mlijeka kao sredstva za prijenos lijekova ili aditiva te unaprijeđenje znanja za proizvodnju zamjenskih mliječnih proizvoda.

Exosomen sind membranhaltige Vesikel, denen eine Hauptrolle in der interzellulären Kommunikation zugesprochen wird. Milch sichert die Nährstoffversorgung, überträgt Immunität und fördert die optimale Entwicklung von Neugeborenen, wobei Exosomen wahrscheinlich zentrale Funktion haben. Das Verhältnis von ω-6 zu ω-3 mehrfach ungesättigte Fettsäuren (PUFA) in der Nahrung nimmt Einfluss auf die Gesundheit und auf Entzündungsprozesse, und kann auch die Fettsäurezusammensetzung des Milchfetts verändern. Ob diese Veränderungen auch das Proteom und Lipidom der in der Milch enthaltenen Exosomen betreffen, ist bisher unzureichend untersucht. Milchproben von Sauen wurden 0, 7 und 14 Tage post partum von Sauen gewonnen, welche entweder einen erhöhten ω-3 (ω-6:ω-3 = 4:1) Anteil in Futter oder eine Standardration (ω-6:ω-3 = 13:1) erhielten. Im Weiteren wurden die Exosomen aus der Milch mittlels Ultrazentrifugation und Größenausschlusschromatographie isoliert und anschließend mit Nanopartikel-TrackingAnalyse, Transmissionselektronenmikroskopie und dem Nachweis von Markerproteinen mittels Western Blot charakterisiert. Das Proteom wurde mittels TandemMassenspektrometrie, das Lipidom mit einem ungerichteten Metabolomics-Verfahren (liquid chromatography-quadrupole time-of-flight mass spectrometry) analysiert. Insgesamt wurden 319 Proteine/Zeitpunkt bei den aus der Milch isolierten Exosomen identifiziert. Im Vergleich zu den Isolaten von Tag 7 post partum wurden bei den aus Kolostrum isolierten Exosomen 162 in unterschiedlicher Menge vorliegende Proteine (differentially abundant proteins; DAP) gefunden, im Vergleich zu Tag 14 wurden 170 DAP identifiziert. Die DAP weisen auf eine veränderte biologische Funktion wie z.B. die Aufnahme von Metaboliten, die Regulierung der Homöostase oder eine veränderte Zellentwicklung hin. Insgesamt wurden in Kolostrum- und Milchexosomen 947 Lipide aus sechzehn Subklassen identifiziert. Im Vergleich zwischen Kolostrum- und Milchexosomen wurden an Tag 7 post partum 734 unterschiedlicher Menge vorliegende Lipide (differentially abundant lipids; DAL) identifiziert und 779 DAL an Tag 14. Die unterscheidlichen Futterrationen wirkten sich auf das Proteom der Milchexosomen aus, nicht aber auf ihr Lipidom. Die Ergebnisse zeigen ein unterschiedliches Proteom- und LipidomProfil in Milchexosomen von Sauen in verschiedenen Laktationsstadien, was Auswirkungen auf ihre funktionelle Biologie hat. Zudem sind die Resultate für mögliche Ansätze zurVerwendung von Milchexosomen als Vesikel für die Verabreichung von Medikamenten oder Zusatzstoffen von Bedeutung.