| Abstract | The overall aim of this thesis was to apply an OMICs approach to investigate the various
effects of broiler diets supplemented with citrus or cucumber plant extracts under control
and Escherichia coli LPS challenge conditions. Our overall hypothesis was that these diets
conferred an advantage over the normal diet in terms of performance and resilience to a toxic
challenge mimicking a gram-negative infection.
To investigate this, samples were collected from two in vivo trials on broiler chickens which
were performed at the Cochno farm facilities at the University of Glasgow. The first dietary
trial (10birds x 4replicates x 3diets) is described in Chapter 2 and was carried out to test the
hypothesis that a baseline diet (CTL) supplemented with citrus (CTS) or cucumber (CMB)
extracts improves the gut health of broiler chickens through the modulation of the gut
microbiota leading to improved growth performance over a period of 28d. The second
dietary trial (12 birds x4 replicates x3 diets) was performed to test the effects of CTL, CTS
and CMB diets on the acute phase response (APR) of broiler chickens, in terms of a range
of acute phase proteins (APPs) plasma biomarkers (traditional and novel) (chapter 3). The
APR to an E. coli LPS challenge at 15d old was monitored in plasma and tissues over a
period of 48h using different sampling time points (T0,12,24,48h) pre and post challenge as
a means of gauging whether this response was altered by the extract diets, this included study
of the proteome of liver and muscle (described in chapter 4) and the metabolome of liver
and muscle (described in chapters 5 and 6).
For the microbiota investigation (Chapter 2), performance data and tissue samples were
collected to evaluate the gut health of broilers on CTL, CTS or CMB dietary administration.
Data on body weight (BW), feed intake (FI) and feed conversion ratio (FCR) were collected
at day 0,7,14,21 and 28d of age to evaluate growth performance, while gut samples were
collected at 14 and 28d of age to study the effects diet on the gut microbiota composition
and gut morphology (villus length, epithelium height and crypt depth). In this study neither
CTS nor CMB diets showed any difference in gut morphometric measurements or significant
improvement in growth performance. Likewise dietary treatment had little or no effect on
the overall bacterial taxonomy of either the jejunum or caeca, but subtle and potentially
beneficial treatment effects were revealed in terms of the abundance of certain bacterial
strains in one or both tissues. These results suggest that the use of citrus and cucumber
extracts in broilers diet produce only very subtle effects in terms of promoting gut health in
broiler chickens.
The following chapters 3,4,5 and 6 used data and samples collected from trial 2 where
broilers underwent LPS challenge at 15d old. In Chapter 3, the APR response of broilers was
evaluated in plasma samples using two established Acute Phase Proteins (APPs) biomarkers
(Alpha 1 acid glycoprotein (AGP) and Serum amyloid A (SAA) and three novel APPs
(Hemopexin (Hpx), Extracellular fatty acid binding protein (Ex-FABP), and MRP-126) at
T0,12,24 and 48h pre and post LPS challenge. SAA, AGP, Ex-FABP and Hpx concentration
were evaluated using the enzyme-linked immunosorbent (ELISA) assay while MRP-126
was measured using a novel SPARCLTM assay. No dietary modulation of the APR was
identified in terms of either the novel or established APPs despite there being a strong LPS
influence on their relative abundance at either 12 or 24h post challenge. While SAA showed
the greatest response, Ex-FABP showed a strong response to LPS at 12h, and we believe can
be classified as a major APP. While both Hpx and AGP peaked at 24h post challenge they
were classified as moderate APPs. The results for MRP-126 were inconclusive and
suggested that the diagnostic assay requires further refinement.
In Chapter 4, I report the proteomic investigation of liver and muscle samples collected from
broilers fed each dietary treatment pre (T0) and T12h post LPS challenge. The LPS challenge
caused an increase in abundance of a range of liver proteins including so called heat shock
proteins (Hsps) at T12h. Interestingly no effects of LPS were observed in muscle. In terms
of dietary treatment, the CTS diet revealed promising results in terms of modulating the APR
post LPS challenge in that those proteins associated with heat stress were less abundant (e.g.
< Hsp90), whilst others associated with accelerated metabolism were increased in liver (e.g
> lactate dehydrogenase (LDHA) and muscle (e.g > Glyceraldehyde-3-Phosphate
Dehydrogenase (GAPDH)) compared to the CTL samples. Western Blot (WB) validation
for 3 selected proteins (HSP90, LDHA and GAPDH) was inconclusive, so at best it can be
concluded that the CTS dietary effect was subtle but promising. Only minor dietary effects
were revealed for tissues obtained from the CMB dietary treatment.
In Chapter 5 and 6, plasma and liver samples from all dietary treatments, pre (0h) and post
LPS challenge (12,24 and 48h), were analysed using Untargeted metabolomics with one
pooled study on plasma comparing all dietary treatments and 1 individual sample study on
plasma comparing CTL and CTS only, and 1 pooled study on liver comparing all dietary
treatments. The pooled studies were based samples from pens 1-12, diets (CTL, CTS and
CMB) and LPS challenge time points (0,12,24 and 48h) while the complete study only
compared individual samples from the CTL and CTS diets as the CMB diet did not show
any metabolome/metabolites modulation in the pooled pilot study. These pilot studies revealed that the overall plasma and liver metabolome were modulated by the LPS challenge
over the 48h with the biggest change found at 12h post challenge. In particular the CTS diet
showed a strong modulation of adenosine, along with multiple amino acid, carbohydrate,
and nucleotide metabolic pathways all of which again suggest a modulation of the immune
response for CTS.
In summary, this thesis applied an Omics approaches to investigate the use of novel plant
extracts in the diet of broiler chickens. While there are some potential beneficial effects of
these dietary treatments, especially CTS, further study of some of the latter’s individual
constituents seems warranted. |
| Abstract (croatian) | Uvod i ciljevi
Novi biljni ekstrakti, limuna i krastavca, ustanovljeni su kao moguće alternative antibiotskim
poticateljima rasta u obrocima tovnih pilića (Savoia, 2012). Prisustvo aktivnih tvari u limunu
i krastavcu čini ih potencijalnim kandidatima za modulaciju obrambenog sustava, bakterija,
proteina i metabolita tovnih pilića (Ndayishimiye i sur. 2018.; Goliomytis i sur., 2019.;
Nema i sur., 2011.; Tang i sur., 2010). Omika tehnologije mogu biti upotrebljene za detaljno
istraživanje ovih interakcija. Cilj ovog doktorskog rada bio je primjena OMICa pristupa
istražiti učinke obroka tovnih pilića s dodatkom biljnih ekstrakta limuna i krastavaca u
odnosu na kontrolnu skupinu i tretman s LPS-om podrijetlom od bakterije Escherichia Coli.
Da bi istražili ovaj cilj, provedena su sljedeća istraživanja: 1) Istraživanje sastava mikrobiote
i učinaka rasta tovnih pilića kao odgovor na eksperimentalno dodavanje obroku biljnih
ekstrakata limuna i krastavca; 2) Istraživanje uspoređujući APR tovnih pilića koji su hranjeni
s jednim ili drugim obročnim tretmanom, primjenom postojećih i novih biomarkera proteina
akutne faze prije i poslije izlaganja LPSom; 3) Proteomska i metabolomska istraživanja
dvaju ključnih tkiva (jetre i mišićja) uzorkovana od tovnih pilića prije i poslije izlaganja
LPSom koji su hranjeni obrocima koji su obogaćeni bilo ekstraktima limuna ili krastavaca.
Materijali i metode
Uzorci su sakupljeni u dva in vivo pokusa na tovnim pilićima koji su provedeni na Cochno
farmi Sveučilišta u Glasgowu. Prvo istraživanje (10 pilića x 4 ponavljanja x 3 obročna
tretmana) provedeno je kako bi se testirala hipoteza da osnovna prehrana (CTL) dopunjena
s ekstraktom limuna (CTS) i krastavca (CMB) poboljšava zdravlje crijeva tovnih pilića
modulirajući crijevne mikrobiote što dovodi do poboljšanja rasta tijekom razdoblja od 28
dana. Drugo istraživanje (12 pilića x 4 ponavljanja x 3 obročna tretmana) provedeno je kako
bi se testirali učinci CTL, CTS i CMB u obroku na APR tovnih pilića, u smislu vrijednosti
APP biomarkera u plazmi (tradicionalnih i novih), proteoma jetre i mišića, i metaboloma
jetre i mišića prije i poslije izlaganja LPSom, 15. dana starosti. APR odgovor je praćen u
plazmi i tkivu tijekom perioda od 48 sati korištenjem raznih vremenskih točaka uzorkovanja
(T0, 12, 24, 48) prije i poslije izlaganja LPSom.
Za istraživanje mikrobiote crijeva prikupljeni su podaci o performansama i uzorcima tkiva
kako bi procijenili zdravlje crijeva tovnih pilića na CTL, CTS ili CMB prehrani. Da bi
procijenili performanse rasta sakupljeni su podaci o tjelesnoj težini (BW), unosu hrane (FI)
i konverziji hrane (FCR) 0, 7, 14, 21, i 28 dana starosti, dok su uzorci crijeva prikupljeni 1412
i 28 dana starosti da bi istražili obroka na mikrobiotu crijeva i morfologiju crijeva (dužinu
vila, visinu epitela i dubinu kripte). DNA svakog uzorka ekstrahiran je pomoću DNeasy
PowerSoil Pro kita (Qiagen, Manchester, UK) i umnožen dvostupanjskim 16S specifičnim
PCR-om koji je koristio V3-V4 regije kao metu (Bukin i sur., 2019). Nakon PCR-a,
amplikoni su kvantificirani i razrijeđeni do ekvimolarne koncentracije, Illumina biblioteka
je pripremljena, a uzorci su sekvencirani korištenjem Illumina MiSeq platforme (Illumina,
San Diego, CA, SAD). Nakon što su dobivene sekvence, analizirane su pomoću QIIME
softvera v2. i analiza raznolikosti korištena je za proučavanje raznolikosti, odnosno
unutar i među uzorcima. Veličina učinka linearne diskriminacijske analize (LEfSE)
korištena je za identifikaciju specifičnih bakterijskih sojeva u uzorcima bakterijske zajednice
modulirane jednom od eksperimentalnih varijabli (npr. prehrana, tkivo, dob peradi).
Uzorci plazme i tkiva iz pokusa 2, gdje su tovni pilići bili podvrgnuti LPS-u u dobi od 15
dana, korišteni su za istraživanja APP-a, proteoma i metaboloma.
APR odgovor tovnih pilića procijenjen je u uzorcima plazme pomoću dva dokazana
biomarkera proteina akutne faze (APP) (AGP i SAA) i tri nova APP (Hpx, Ex-FABP i MRP-
126) i to na T0, 12, 24 i 48 sati prije i nakon LPS izazova. Koncentracija SAA, AGP, ExFABP i Hpx procijenjena je pomoću ELISA testa, dok je MRP-126 mjeren pomoću novog
SPARCLTM testa. Proteini od interesa potvrđeni su korištenjem Western blot (WB) metode.
Provedene su dvije proteomske studije kako bi se procijenili učinci CTS i CMB naspram
CTL obroka, i to T12h nakon izlaganja LPS-u, i učinak LPS izlaganja tijekom prvog T12h
nakon izlaganja CTL-u, na jetru i mišiće tovnih pilića. Uzorci su ekstrahirani, kvantificirana
njihova ukupna koncentracija proteina kvantificirana je primjenom metode bicinhoninske
kiseline (BCA), a zatim obrađeni digestijom tripsinom korištenjem protokola pripreme
uzorka uz pomoć filtera (FASP) i označavanja putem izobarnih privjesaka (TMT).
Provedena je LC-MS/MS analiza visoke rezolucije TMT-obilježenih peptida i analizirani su
dobiveni MS/MS spektri za identifikaciju i kvantifikaciju proteina korištenjem SEQUEST
algoritma implementiranog u Proteome Discoverer. Statističke analize rađene su u programu
RStudiu. UniProtKB alat za mapiranje ID-a i alat za pretvorbu DAVID korišteni su za
pretvaranje GI pristupnih brojeva u službeni simbol gena. Analiza obogaćivanja genske
ontologije provedena je korištenjem alata za klasifikaciju analize proteina kroz evolucijski
odnos (PANTHER).13
Tri neciljana metabolomska istraživanja (temeljena na LC-MSu) provedene su na uzorcima
plazme i jetre iz svih obročnih skupina, prije (0h) i nakon LPS (12, 24 i 48 sati) (1 pilot
studija na plazmi koja je uspoređivala sve obročne pristupe, 1 kompletna studija na plazmi
koja uspoređuje samo CTL i CTS, i 1 pilot studija o jetri koja uspoređuje sve obročne
skupine). U pilot studijama uzorci su objedinjeni na temelju skupina u kavezu (1-12),
prehrane (CTL, CTS i CMB) i vremenskih točaka izlaganja LPS-u (0, 12, 24 i 48 sati), dok
je cjelovita studija uspoređivala neobjedinjene uzorke iz CTL i CTS obročne skupine jer
CMB obročna skupina nije pokazala nikakvu modulaciju metaboloma/metabolita u skupnoj
plazmi u okviru pilot studije. U sve tri studije uzorci su ekstrahirani korištenjem
kloroforma/metanola/vode (1:3:1) i odvojeni tekućinskom kromatografijom (LC) prije MS
identifikacije. Podaci dobiveni iz MS-a istraženi su korištenjem programa Polyomics
integriranog Metabolomics Pipeline-a (PiMP), koji identificira metabolite, i programa
MetaboAnalysta koji omogućuje statističku analizu. Posljednja faza analize uključuje
biološku interpretaciju rezultata i raspravu.
Rezultati
Usredotočujući se na prvo istraživanje, CTS i CMB obroci nisu pokazali komercijalno
vrijedne rezultate u smislu poboljšanja rasta i nije bilo razlike u morfometrijskim mjerenjima
crijeva. Isto tako, obročni tretman imao je mali ili nikakav učinak na ukupnu bakterijsku
taksonomiju jejunuma ili cekuma, ali otkriveni su suptilni i potencijalno korisni učinci u
smislu rasprostranjenosti određenih bakterijskih sojeva u jejunumu i cekumu. Najveći
učinak je pronađen povezan s upotrebom CTS-a gdje se broj korisnih bakterija, uključujući
Lactobacilli, povećao u jejunumu, a Blautia u cekumu. Ostale potencijalne patogene
bakterije smanjene su u jejunumu (Enterococcus i Clostridia) i cekumu (Enterococcus). Ovi
rezultati sugeriraju da upotreba ekstrakata limuna i krastavaca u prehrani tovnih pilića ima
vrlo suptilne učinke u smislu poboljšanja zdravlja crijeva kod tovnih pilića.
Na temelju drugog istraživanja i primjene LPS-a, nije ustanovljena obročna modulacija
APR-a u smislu novih ili etabliranih proteina akutne faze (APP) unatoč snažnom utjecaju
LPS-a na njihovu relativnu koncentraciju 12 ili 24 sata nakon primjene LPSa. Ex-FABP
pokazao je vrlo snažan odgovor na LPS nakon 12 sati, usporediv sa SAA. Pod ovim
eksperimentalnim uvjetima Ex-FABP se stoga može klasificirati kao glavni APP. Hpx je bio
usporediv s AGP-om, dostigavši vrhunac 24 sata nakon LPSa i stoga se može klasificirati
kao umjereni APP u ovim eksperimentalnim uvjetima. Nažalost, rezultati za MRP-126 nisu
bili uvjerljivi i sugerirali su da dijagnostički test zahtijeva daljnje usavršavanje.14
U proteomskim istraživanjima, otkriveno je da LPS uzrokuje povećanje koncentracije niza
proteina u jetri, uključujući proteine toplinskog stresa (HSP) i aktin u T12h. Zanimljivo je
da nikakvi učinci LPS-a nisu primijećeni u mišićima. Što se tiče obročnog tretmana, CTS u
obroku pokazao je obećavajuće rezultate u pogledu APR-a, naročito stoga što su proteini
povezani s toplinskim stresom bili manje zastupljeni (npr. < HSP 90), dok su drugi povezani
s ubrzanim metabolizmom bili povećani u jetri (npr. > laktat dehidrogenaza (LDHA) ) i
mišiću (npr. > gliceraldehid-3-fosfat dehidrogenaza (GAPDH)) u usporedbi s CTL uzorcima
nakon izlaganja LPS-om. Te se razlike, međutim ne mogu u potpunosti potvrditi pomoću
metode Western Blot (WB) pa se u najboljem slučaju može zaključiti da CTS u obroku ima
suptilan utjecaj. Nisu otkriveni nikakvi učinci prehrane na tkiva dobivena obročnim
tretmanom CMB-om.
Na temelju rezultata metabolomskih istraživanja, pilot studije su otkrile da su cjelokupni
metabolom plazme i jetre modulirani LPS, kao što je predviđeno u svim vremenskim
točkama, pri čemu se najveća promjena dogodila 12 sati nakon izazova uzrokujući smanjenje
količine višestrukih aminokiselina, ugljikohidrata i uzrokujući značajne promjene u
biološkim putevima. Uspoređujući obročne tretmane, CTS u obroku je jedini pokazao
potencijalno zanimljive rezultate sa snažnom modulacijom za adenozin u plaazmi prije i 12
sati nakon LPS. Moguća interakcija između bioaktivnih spojeva u CTS obroku (tj. pektina,
flavonoida, limonena) i adenozina naknadno je pretpostavljena i istražena, ali nije dokazana.
Adenozin, zajedno s metaboličkim putevima višestrukih aminokiselina, ugljikohidrata i
nukleotida također su pokazali da su pod utjecajem davanja CTS u obroku (uglavnom
povećanjem njihovih intermedijara) u jetri. Budući bi se rad trebao usredotočiti na
istraživanje značaja CTS modulacije na adenozin, spoj za koji se zna da igra važnu ulogu u
modulaciji imunološkog sustava kod ljudi i životinja.
Zaključak
Opisana istraživanja imala su za cilj procijeniti učinke dvaju novih biljnih ekstrakata (CTS
i CMB) na performanse tovnih pilića tijekom normalnih fizioloških uvjeta i nakon izlaganja
LPS-u. Ova dva nova ekstrakta odabrana su na preporuku našeg industrijskog partnera
NuScience koji je izvijestio da su, zbog njihovih bioaktivnih komponenti, pokazali
obećavajuće rezultate, kao alternativu korištenju antibiotika kao poticatelja rasta u hranidbi
tovnih pilića. Na temelju naših eksperimentalnih nalaza, iako postoje neki potencijalni
korisni učinci ovih obročnih tretmana, posebno CTS-a, daljnje proučavanje nekih
pojedinačnih sastojaka potonjeg čini se opravdanim. |
