| Abstract | Pectins are major components of the plant primary cell wall and the most heterogeneous cell wall polysaccharides. They comprise several domains, the most abundant being homogalacturonan (HG), built on a simple Gal A backbone which can be methyl esterified and acetylated. HG constant remodeling is mediated through the action of HG-modifying enzymes that are acting during plant development. As such, these enzymes play a key role in the maturation and degradation of HG, therefore controlling cell wall rheology. Polygalacturonases (PGs) are an essential class of HG-modifying enzymes as they degrade HG chains and produce oligogalacturonides (OGs) of various size and structure. As PG are encoded by a large multigenic family of 69 genes in Arabidopsis, this represents a major challenge for reverse genetic approaches. As an alternative; we chose exogenous application of recombinant enzyme to study their role during plant development. During this thesis, two PGs were studied, AtPGAZAT and AtPGLR, which genes are both expressed in roots. Both proteins were heterogously produced in Pichia pastoris as active enzymes and their biochemical properties and mode of action were compared. Their roles in planta was assessed through exogenous application of the enzymes and analysis of the phenotypical consequences on light- and dark-grown Arabidopsis thaliana seedlings. On the basis of the results, the main differences between these endo-PGs lie in their substrate specificity, as AtPGAZAT shows higher activity on highly methyl esterified pectins compared to AtPGLR. Furthermore, size exclusion chromatography coupled to mass spectrometry revealed difference in their mode of actions. Indeed, OG profiles obtained after hydrolysis of hypocotyl cell wall by AtPGAZAT generates higher abundance of methyl esterified, while AtPGLR generates acetyl esterified OGs. These subtle distinctions in their mode of action could be connected to differences in observed phenotypes after exogenous application on light grown plants and dark-grown hypocotyls. |
| Abstract (french) | Les pectines, polysaccharides majeur des parois primaires sont aussi les plus hétérogènes. Ils sont constitués de plusieurs domaines dont les plus simples sont les homogalacturonanes (HG), enchainements linéaires d’acide galacturonique (GalA) dont les unités peuvent être à la fois méthylées et acetylées. La structure des HGs est constamment modifiée au cours du développement des plantes par l’action d’enzymes de remodelage. En tant que tel, elles jouent un rôle de premier plan dans le remodelage des HG et participent ainsi au contrôle de la rhéologie pariétale. En particulier, les Polygalacturonases (PGs), une famille multigénique de 69 membres chez Arabidopsis, dégradent les HG en hydrolysant les liaisons glycosidiques entre deux GalA successifs pour produire des oligogalacturonides (OGs) de taille et structure variées. Ce nombre important d’isoformes complique leur étude par génétique inverse. Au laboratoire, une approche alternative est conduite, qui consiste en l’application exogène des enzymes recombinantes et l’étude de leurs conséquences sur le développement. Pendant ce stage, nous avons choisi d’étudier AtPGAZAT et AtPGLR, deux enzymes, dont les gènes sont exprimés aux sites d’émergence des racines latérales. Ces enzymes ont été produites en système hétérologue Pichia pastoris et caractérisées biochimiquement, de même que leur mode d’action. Leurs impacts dans le cadre de l’allongement de l’hypocotyle à l’obscurité et du développement des plantules à la lumière, a été évalué par analyse des phénotypes engendrés après application. Les principaux résultats ont permis de conclure que contrairement à AtPGLR, AtPGAZAT est capable d’hydrolyser les substrats hautement méthylestérifiés. Le mode d’action de ces endo-PGs, déterminé par chromatographie à exclusion de taille couplée à la spectrométrie de masse, confirme ces données puisque AtPGAZAT hydrolyse la paroi d’hypocotyle étiolé en générant une grande proportion d’OGs méthylés. En parallèle, AtPGLR digère préférentillement les HGs dans les regions acétylées. Ces différences dans leur mode d’action pourraient partiellement expliquer les différences phénotypiques observées lors des applications exogènes sur les deux modèles développementaux. |
