Naslov Kromatografska izolacija izvanstaničnih vezikula iz cerebrospinalne tekućine bolesnika s teškom ozljedom mozga Naslov (engleski) Size-exclusion chromatography-based isolation of extracellular vesicles from cerebrospinal fluid of patients with severe traumatic brain injury Autor Mia Krapić Mentor Kristina Grabušić (mentor)Član povjerenstva Mladenka Malenica Staver (predsjednik povjerenstva)Član povjerenstva Miranda Mladinić Pejatović (član povjerenstva)Član povjerenstva Kristina Grabušić (član povjerenstva)Ustanova koja je dodijelila Sveučilište u Rijeci Datum i država obrane 2018-09-27, Hrvatska Znanstveno / umjetničko BIOTEHNIČKE ZNANOSTI Sažetak Severe traumatic brain injury (TBI) is intracranial damage caused by external force and is the leading cause of death and disability among young people. The damage to brain tissue involves a complex and mostly long-lasting cascade of pathological processes such as inflammation, excitotoxicity and apoptosis, which are targeted for management during the critical care. Although a full recovery after severe TBI is possible, the mechanisms of neuroregeneration and thus targeted measures to support neuro-recovery are unknown. However, intercellular communication between neurons and glia cells is cellular activity vital for the renewal of old synapses and establishment of new ones.
Newly described potential mediators of intercellular communication in the brain are extracellular vesicles (EVs). EVs are nanosized particles enveloped with phospholipid bilayer and capable of transporting proteins, lipids and nucleic acids between cells. The previous study discovered that cerebrospinal fluid (CSF) of patients with severe TBI shows dynamic changes in both physical properties of EVs and levels of neuroregeneration-associated proteins. This EV dynamics indicates possible neuro-recovery response of the brain. The goal of this research was to enable analysis of EV-proteome by isolating total EVs from clinical CSFs after severe TBI.
An in-house size-exclusion chromatography (SEC) based on sepharose CL-6B was developed in this work and used it to separate total EVs from CSF pools of 6 control patients and 6 severe TBI patients. After collection, SEC fractions were characterised by 3 independent methods: immunoblot analysis for CD9 protein (i) and acetylcholinesterase (AChE) assay (ii) as well-established EV protein markers and Bradford assay (iii) to determine the total protein concentration. These quantifications of SEC fractions resulted in partially overlapping curves with AChE and CD9 peaks detected in earlier fractions than
III
total protein peak. The results indicate a successful separation of EVs from soluble proteins enabling the proteome analysis by mass spectrometry.
Sažetak (hrvatski) Teška traumatska ozljeda mozga je intrakranijalno oštećenje uzrokovano vanjskom silom te je vodeći uzrok smrtnosti i invaliditeta u mladih ljudi. Ozljeda moždanog tkiva uključuje složenu i dugotrajnu kaskadu patoloških procesa poput upale, ekscitotoksičnosti i apoptoze, a liječenje bolesnika u kritičnom stanju je usmjereno na ublažavanje tih negativnih procesa. Iako je potpuni oporavak nakon ozljede moguć, mehanizmi neuroregeneracije kao i potencijalne mjere koje bi je poticale još uvijek nisu otkrivene. Međutim, oporavak starih sinapsi i stvaranje novih ovisi o međustaničnoj komunikaciji između neurona i glija stanica.
Novi potencijalni posrednici međustanične komunikacije u mozgu su izvanstanične vezikule (IV). IV su nanočestice obavijene fosfolipidnom membranom i mogu prenositi lipide, proteine i nukleinske kiseline između stanica. U prethodnom istraživanju pokazalo se da u cerebrospinalnoj tekućini pacijenata s teškom traumatskom ozljedom mozga dolazi do dinamičnih promjena fizikalnih svojstava IV-a i razina proteina uključenih u neuroregeneraciju. Te promjene ukazuju na moguće procese neuroregeneracije. Cilj ovog istraživanja bio je izolirati ukupne IV iz kliničkih uzoraka cerebrospinalne tekućine nakon teške traumatske ozljede mozga i time omogućiti analizu njihova proteoma.
Kromatografska metoda na bazi sefaroze CL-6B razvijena je tijekom ovog rada i primijenjena za razdvajanje ukupnih IV-a iz cerebrospinalne tekućine 6 kontrolnih i 6 bolesnika s teškom traumatskom ozljedom mozga. Sakupljene kromatografske frakcije karakterizirane su pomoću 3 metode: imunoblot analizom za CD9 protein (i), esejem za acetilkolinesteraznu aktivnost (AChE) (ii), koji su poznati proteinski markeri IV-a te Bradford esejem (iii) kojim se odredila koncentracija ukupnih proteina. Kvantifikacija frakcija rezultirala je krivuljama koje su se djelomično preklapale. Vrhovi krivulja AChE i CD9
V
detektirani su u ranijim frakcijama u odnosu na ukupne proteine. Rezultati ukazuju na uspješno razdvajanje IV-a od solubilnih proteina čime je omogućena njihova daljnja proteomska analiza masenom spektrometrijom.
Ključne riječi
Size-exclusion chromatography
severe traumatic brain injury
extracellular vesicles
neuroregeneration
cerebrospinal fluid
Ključne riječi (hrvatski)
gel-filtracija
teška traumatska ozljeda mozga
izvanstanične vezikule
neuroregeneracija
cerebrospinalna tekućina
Jezik engleski URN:NBN urn:nbn:hr:193:633677 Studijski program Naziv: Biotehnologija u medicini Vrsta resursa Tekst Način izrade datoteke Izvorno digitalna Prava pristupa Otvoreni pristup Uvjeti korištenja Datum i vrijeme pohrane 2018-10-31 09:40:55
