Naslov Analiza N-glikoma IgG u serumu štakora
Naslov (engleski) Analysis of the rat serume IgG N-glycome
Autor Iris Car
Mentor Sandra Kraljević Pavelić (mentor)
Član povjerenstva Dean Marković (predsjednik povjerenstva)
Član povjerenstva Sandra Kraljević Pavelić (član povjerenstva)
Član povjerenstva Đuro Josić (član povjerenstva)
Ustanova koja je dodijelila akademski / stručni stupanj Sveučilište u Rijeci (Fakultet biotehnologije i razvoja lijekova) Rijeka
Datum i država obrane 2019-01-16, Hrvatska
Znanstveno / umjetničko područje, polje i grana BIOTEHNIČKE ZNANOSTI Biotehnologija
Sažetak Imunoglobulin gama (IgG) je najzastupljenije protutijelo u serumu. Njegove imunološke funkcije regulirane su posttranslacijskim modifikacijama glikozilacijama. N-glikozilacije IgG se odnose na šećerne skupine vezane za IgG preko aminokiseline asparagin na poziciji 297 u polipeptidnom lancu. Šećerne skupine fukoza, galaktoza ili sijalinska kiselina važne su za regulaciju protuupalnih ili proupalnih svojstava IgG tako što utječu na vezanje regije Fc IgG na aktivirajuće ili inhibirajuće receptore Fc gama na imunološkim stanicama. Fiziološki status te stres mogu utjecati na N-glikozilaciju IgG zbog čega istraživanje profila N-glikoma može omogućiti otkriće novih biomarkera. Uz miševe, štakori su drugi najčešće korišteni modelni organizam u znanstvenim istraživanjima. Karakterizacija N-glikoma IgG zdravog štakora može se stoga koristiti u istraživanjima patogeneze bolesti ili za analize mehanizama djelovanja lijekova. Analiza N-glikoma je tehnički vrlo zahtjevna i ovisi o metodama za izolaciju, pročišćavanje i identifikaciju N-glikana. Izolacija IgG iz seruma štakora u ovom je radu provedena uz pomoć afinitetne visokoprotočne monolitne kromatografije. Prednost korištenja monolitnih kolona je u kraćem vremenu analize, većoj rezolucijite boljoj stabilnosti kolone pri većim tlakovima. Kao ligand za vezanje IgG je korišten imobilizirani protein L zbog visokog afiniteta za kapa lake lance IgG. Potvrda izolacije IgG provedena je uz pomoć MALDI-TOF masene spektrometrije (MS). U radu su također uspoređeni protokoli za tripsinsku digestiju u gelu iz literature s protokolom razvijenim na Odjelu za biotehnologiju, tzv. in-house protokol. Usporedba je pokazala da je s protokolom iz literature identifikacija IgG uz pomoć MALDI-TOF MS bila pouzdanija . Identifikacija N-glikana provedena je također uz pomoć MALDI TOF MS nakon derivatizacije glikana čime se omogućila identifikacija glikana koji sadrže ostatak α2,6-NeuAc.
Tehnička reproducibilnost identifikcije N-glikana u serumu štakora nije bila zadovoljavajuća te je protokol za pripremu uzorka potrebno dalje optimizirati.
Sažetak (engleski) Immunoglobulin gamma is the most abundant antibody present in serum. Its functions are regulated by glycosylation which is a type of posttranslational protein modification. IgG N-glycosylation describes oligosaccharides linked to the polypeptide chain through the asparagine residue 297. Sugar moieties such as fucose, galactose or sialic acid mediate IgG’s anti-inflammatory or pro-inflammatory properties by affecting the binding of the Fc region on IgG to activating or inhibitory Fc gamma receptors located on immune cells. Due to the fact that the physiological state and stress have a great impact on IgG N-glycosylation, research of N-glycome profiles can result with discovering novel biomarkers. After mice, rats are the second most used animal model in scientific research. Characterization of IgG N-glycome of a healthy rat can be compared to physiologically altered states such as disease, or it can be used to analyze drug mechanisms of action. N-glycome analyzes are technically very challenging and therefore strongly depend on implementing precise and sensitive methods for isolation, purification and identification of N linked glycans. In this thesis, isolation of IgG from rat serum was performed by affinity monolithic chromatography. Advantages of using monolithic columns include shorter time of analysis, narrower detection peak and, greater physical stability at higher pressures. Immobilized protein L was used as a ligand due to high affinity for IgG kappa light chains. Confirmation of IgG isolation was performed by MALDI-TOF mass spectrometry. A comparison between protocols for in-gel tryptic digestion was carried out wherein a protocol developed by Shevchenko et al.. was compared with an in-house protocol developed at the Department of Biotechnology. The comparison showed that the protocol developed Shevchenko et al. achieved more reliable results compared to the results obtained through the in-house developed protocol. N-glycan identification was performed using MALDI-TOF MS. Identification of glycans largely depends on the derivatization process. Derivatization protocols used in this thesis have not achieved the desired technical reproducibility for all samples and glycans from only two samples were successfully identified. In the future, better protocol optimization could identify the complete N-glycan profile of IgG.
Ključne riječi
imunoglobulin G
glikozilacija
afinitetna monolitna kromatografija
MALDI-TOF masena spektrometrija
Ključne riječi (engleski)
immunoglobulin G
glycosylation
affinity monolithic chromatography
MALDI-TOF mass spectrometry
Jezik hrvatski
URN:NBN urn:nbn:hr:193:434655
Studijski program Naziv: Biotehnologija u medicini Vrsta studija: sveučilišni Stupanj studija: diplomski Akademski / stručni naziv: magistar/magistra biotehnologije u medicini (mag. biotech. in med.)
Vrsta resursa Tekst
Način izrade datoteke Izvorno digitalna
Prava pristupa Otvoreni pristup Datum isteka embarga: 2023-01-01
Uvjeti korištenja
Datum i vrijeme pohrane 2019-03-06 09:14:39