| Sažetak | Viruses significantly perturb cell metabolism during infection and guide
their functions toward efficient virus replication. Previous studies have shown that
herpes simplex virus 1, while also encoding its own microRNAs (miRNAs), leads
to significant changes in host miRNA expression. However, the exact role of such
deregulation has not been elucidated. In this study, we comprehensively
analyzed host and HSV-1 encoded miRNAs during productive and latent infection
by applying a next-generation sequencing approach and bioinformatic analyses
followed by functional studies.
Firstly, to study host miRNA changes during productive HSV-1 infection,
we determined differentially expressed miRNAs in various HSV-1 infected cells
in culture. We found a cluster of co-expressed host miRNAs, miR-183/96/182,
that was reproducibly upregulated in primary cells. Interestingly, we found that
miRNAs of this cluster share common targets, including the Forkhead box O
(FoxO) family of transcription factors. We observed a slight increase followed by
a decrease of FoxO1 and FoxO3 transcripts and proteins during HSV-1 infection,
which coincided with the expression of the miR-183/96/182. However, we found
that overexpression of the miR-183/96/182 cluster is not required for the depletion
of FoxO proteins. Nonetheless, to further examine the roles of these proteins in
infection, we generated cells deficient for FoxO1 and FoxO3 using the CRISPRCas9 technology. Our results show that individual FoxO1 or FoxO3 protein is not
required for efficient virus infection.
In the second part of the study, we analyzed HSV-1 miRNAs in great detail
by comparing a large number of sequencing experiments (i.e., datasets). One
part of the datasets was generated in-house by sequencing, and the other was
obtained from public databases. Thus far, 29 mature miRNAs have been found
encoded by HSV-1, the functions of which are largely unknown. However, we
have noticed significant discrepancies between reports including a lack of
consistency in miRNA sequences. |
| Sažetak (hrvatski) | Tijekom infekcije virusi značajno mijenjaju biologiju stanice, te pritom
podređuju i usmjeravaju njezine funkcije u smjeru efikasne virusne replikacije.
Prethodne studije su pokazale da herpes simpleks virus 1, osim što kodira svoje
mikroRNA (miRNA), dovodi i do značajnih promjena u ekspresiji miRNA
domaćina, za što se smatra da bi moglo dovoditi do stvaranja pogodnih uvjeta za
replikaciju virusa, no točne uloge tih promjena nisu detaljno analizirane. Kako bi
opširnije prikazali analizu miRNA domaćina te HSV-1, istraživanje je podijeljeno
na dva dijela, prvi dio, koji čini analiza diferencijalnih promjena miRNA domaćina
tijekom infekcije te drugi dio gdje su detaljnije analizirane miRNA HSV-1.
Prvo, kako bi proučili promjene miRNA domaćina tijekom infekcije HSV-1,
napravili smo profil diferencijalno eksprimiranih miRNA, te pokazali da je klaster
miRNA domaćina koje se zajedno eksprimiraju, miR-183/96/182, reproducibilno
povećano eksprimiran u primarnim stanicama u kulturi. Traženjem zajedničkih
meta navedenih miRNA, od potencijalnih kandidata izdvojili smo Forkhead box O
(FoxO) porodicu transkripcijskih faktora te uočili njihovo blago povećanje nakon
kojeg slijedi opadanje razine transkripata te proteina tokom infekcije HSV-1. Kako
bi ispitali ulogu FoxO u infekciji, metodom CRISPR-Cas9 generirali smo stanice
deficijentne za FoxO1 i FoxO3, no, uspoređujući replikaciju, uočili smo da FoxO1
ili FoxO3 ne igraju značajnu ulogu u replikaciji HSV-1.
Drugo, kako bi detaljnije analizirali miRNA HSV-1, generirali smo i prikupili
setove podataka dobivene sekvenciranjem malih RNA molekula uzoraka
inficiranih sa HSV-1. Istraživanja su do sada pokazala da HSV-1 kodira 29 zrelih
miRNA, čija funkcija nije u potpunosti razjašnjena. U tim dosadašnjim otkrićima
sudjelovale su različite istraživačke grupe koje su u svojim istraživanjima
primjenjivale različite kriterije za otkrića novih miRNA što je na kraju rezultiralo
brojnim odstupanjima, uključujući i točne sekvence miRNA HSV-1. Kako bismo
odredili točne sekvence miRNA HSV-1, te ispitali ekspresiju miRNA u latenciji u
uzorcima čovjeka, usporedili smo sekvence miRNA između različitih virusnih
sojeva i kliničkih izolata. Opsežna bioinformatička analiza pokazala je odstupanja
sekvenci miRNA HSV-1 od objavljenih referentnih sekvenci, čime smo definirali najdominantnije sekvence 29 zrelih miRNA molekula HSV-1 u različitim fazama
HSV-1 infekcije kako bi doprinijeli razumijevanju i olakšali buduće funkcionalne
analize ovih miRNA molekula. Također smo kategorizirali sve poznate miRNA
HSV-1 te sugeriramo da neke od prije objavljenih miRNA možda nisu izvorne
regulatorne molekule, već artefakti sekvenciranja. Nadalje, opisujemo značajno
posttranskripcijsko uređivanje hsv1-miR-H2-3p u latentno inficiranim ganglijima
čovjeka, za razliku od in vitro uzoraka u produktivnoj fazi infekcije. Ovi rezultati
ukazuju na to da virus koristi stanične procese kako bi proširio repertoar mogućih
meta miRNA ili na taj način utječe na njihovu stabilnost. |
