Statini spadaju u najčešće propisivane lijekove današnjice za snižavanje lipida u krvi. Iako se za njihovu proizvodnju primjenjuju dobro uhodane kemijske metode, one su dugotrajne i sastoje se od velikog broja koraka. Zbog sve veće potražnje za statinima i zbog zahtjeva za njihovom visokom kemijskom i stereokemijskom čistoćom ulažu se veliki napori u pronalaženju učinkovitih i ekonomski prihvatljivih procesa proizvodnje kiralnih prekursora bočnog lanca statina. Iz tog razloga razvijaju se biokatalitički procesi njihove sinteze. Naime, primjena enzima predstavlja vrlo atraktivnu alternativu kemijskim procesima zbog činjenice da kataliziraju stereoselektivne reakcije pri vrlo blagim reakcijskim uvjetima koje rezultiraju proizvodnjom produkata visoke enantiočistoće. Cilj istraživanja bio je razvoj dviju enzimskih kaskada u svrhu proizvodnje dvaju prekursora statina. Određena je kinetika svake pojedine reakcije unutar postavljenih višeenzimskih sustava te utjecaj svih prisutnih komponenata reakcija (organskih spojeva: supstrata i produkata) na stabilnost enzima. Razvijeni matematički modeli reakcija validirani su u različitim izvedbama reaktora (šaržni reaktor, ponovljivi šaržni reaktor, šaržni reaktor s dotokom). Primjenom validiranih matematičih modela optimirani su reakcijski uvjeti s ciljem proizvodnje optimalne količine ključnih molekula i postizanje visoke volumne produktivnosti. Istraživanje se temeljilo na hipotezama kako će kinetički modeli i informacije o stabilnosti enzima omogućiti definiranje najprikladnije strategije implementacije višeenzimskog sustava, da će se primjenom matematičkog modeliranja utvrditi optimalni reakcijski uvjeti te će optimirani višeenzimski sustav za proizvodnju prekursora bočnih lanaca statina biti atraktivna alternativa trenutno zastupljenim kemijskim metodama. Istraživane kaskade razlikovale su se u polaznim molekulama (supstratima) i primijenjenim enzimima. Supstrati koji su se koristili za potrebu sinteza prekursora bili su ekonomski prihvatljivi i lako dostupni aldehidi, a reakcije su bile katalizirane kombinacijom enzima različitih skupina. Supstrati prve rute bili su kloroacetaldehid (CAA) i acetaldehid (AA), dok su supstrati druge rute bili N-(3-oksopropil)-2-fenilacetamid (OPA) i AA. Prva se kaskada sastojala od enzima 2-deoksiriboza-5-fosfat-aldolaze (DERA), NAD(P)-ovisne dehidrogenaze (DH) i halogenhidrin-dehalogenaze (HHDH001), dok se druga sastojala od enzima DERA i DH, pri čemu su bile korištene različite genetički modificirane varijante enzima DERA i DH. S obzirom na to da su određeni stupnjevi reakcija bili katalizirani enzimom DH, ispitana je mogućnost primjene regeneracije koenzima NAD(P)+ in situ primjenom NAD(P)H-ovisne oksidaze (NOX). Prva reakcijska ruta (slika 1.) sastojala se od dvostruke aldolne adicije, oksidacije te od dehalogenacije i otvaranja prstena epoksida u pristustvu jakoga nukleofila. Dvostruka aldolna adicija bila je katalizirana enzimom DERA (DERATm ili DERA024). Prva aldolna adicija AA na CAA rezultirala je nastajanjem međuprodukta 4-kloro-3-hidroksibutanala (CHB), dok je adicijom druge molekule AA na međuprodukt CHB dobiven konačni aldolni produkt 6-kloro-3,5-dihidroksiheksanal (CDH). Oksidacija dobivenog aldehida CDH-a u 6-kloro-3,5-dihidroksiheksansku kiselinu (CDHA) provedena je primjenom enzima DH. U tu svrhu ispitana su dva različita enzima: NAD-ovisna aldehid dehidrogenaza (AlDH) i NADP-ovisna ketoreduktaza (KRED332). Regeneracija koenzima NAD+ provedena je implementacijom regeneracijskog sustava in situ uvođenjem enzima NADH-ovisne oksidaze (NOX009), koja kao kosupstrat zahtjeva kisik. Treći, a ujedno posljednji stupanj kaskade, bila je reakcija katalizirana enzimom HHDH (HHDH001). Enzim HHDH001 katalizira reakciju dehalogenacije CDHA-a, čime se na mjestu klorida fomira epoksid te nastaje konačni produkt 3-hidroksi-4-(oksiran-2-il)-butanska kiselina (HOBA). Ukoliko se reakcija provodi uz dodatak jakog nukleofila, poput kalijeva cijanida, enzim HHDH001 katalizira dvostupnjevitu reakciju nastanka 6-cijano-3,5-dihidroksiheksanske kiseline (CYDHA) preko gore spomenutog međuprodukta HOBA. Druga reakcijska ruta (slika 2.) sastojala se od dvostruke aldolne adicije i oksidacije nastalog aldolnog produkta. Dvostruke aldolne adicije bila je katalizirana enzimom DERA062, dok je oksidacija aldola bila katalizirana NADP-ovisnom DH (KRED354). Reakcija katalizirana enzimom DERA062 rezultirala je produktom N-(2-((2R,4R)-4,6-dihidroksitetrahidro-2H-piran-2-il)etil)-2-fenilacetamidom (DHP). Nastali aldehid DHP bio je enzimski oksidiran u N-(2-((2R,4R)-4-hidroksi-6-oksotetrahidro-2H-piran-2-il)ethil)-2-fenilacetamid (HOP). Ispitana je mogućnost regeneracije koenzima NADP+ implementacijom regeneracijskog sustava in situ uvođenjem enzima NADPH-ovisne DH. Kao mogući enzimi ispitani su NOX001, enzim koji kao kosupstrat zahtjeva kisik, i KRED011, enzim koji kao kosupstrat zahtjeva aceton (ACE). S obzirom na to da enzim DERA prihvaća AA ujedno kao donor i akceptor, reakcija dvostruke aldolne samoadicije AA rezultira nastankom konačnog produkta 3,5-dihidroksiheksanala (DHH) preko međuprodukta 3-hidroksibutanala (HB) (slika 3.). Razlog provedbe oksidacije u oba slučaja bio je prevođenje konačnog produkta (aldehidi CDH i DHP) u svoj stabilniji oblik (kiseline CDHA i HOP). U slučaju prve rute, oksidacija CDH-a je također bila nužna iz razloga što karbonilni spojevi (aldehidi i ketoni) kemijski reagiraju s cijanidom (CN-) čime dolazi do cijanohidrinske reakcije. Time bi nastali neželjeni nusprodukti, a reakcija bi rezultirala sa smanjenim prinosom na konačnom produktu (prekursoru bočnog lanca statina). Metodologija Analitičke metode Uzorci uzeti iz reakcijske otopine analizirani su primjenom tekućinske kromatografije na kromatografu Shimadzu HPLC (Kyoto, Japan). Aktivnosti svih enzima utvrđene su primjenom eksperimentalno definiranih spektrofotometrijskih testova na spektrofotometru Shimadzu UV-1601 (Kyoto, Japan). Optimalni pH i temperatura Utjecaj različitih pufera, pH i temperature na aktivnost i stabilnost svih korištenih enzima određeni su provedbom spektrofotometrijskih mjerenja. Pošto enzimi DH kataliziraju reakcije pri jednom pH (čime nastaje glavni produkt oksidacije), a regeneracija koenzima odvija se pri drugom pH, pronađen je kompromisan pH temeljem dostupne literature i prikupljenih eksperimentalnih rezultata. Stabilnost enzima Stabilnost enzima određena je miješanjem enzima s različitim koncentracijama supstrata ili produkta, u optimalnom puferu pri optimalnoj temperaturi. Tijekom definiranog razdoblja uzimani su uzorci i mjerena je aktivnost enzima. Iz dobivenih rezultata procijenjene su konstante deaktivacije enzima u prisutnosti svakog pojedinog ispitanog spoja. Regeneracija koenzima Regeneracija koenzima provođena je ili uvođenjem novog enzima u reakcijski sustav (NADH-ovisna NOX) ili primjenom istoga enzima koji katalizira glavnu reakciju oksidacije (NADPH-ovisna KRED), ovisno o enzimu koji katalizira glavnu reakciju oksidacije, odnosno njegovoj specifičnosti prema vrsti upotrijebljenog kofaktora. Količina regeneriranog koenzima praćena je spektrofotometrijski pri 340 nm, s obzirom na to da koenzim NAD(P)H apsorbira svjetlost pri toj valnoj duljini. Kinetička mjerenja Za svaki pojedini biokatalitički stupanj unutar promatranog sustava provedena su nezavisna mjerenja praćenjem ovisnosti početne reakcijske brzine o koncentracijama pojedinih komponenti reakcijskog sustava, to jest primjenom metode početnih reakcijskih brzina. Dobiveni eksperimentalni podaci korišteni su za procjenu kinetičkih parametara. Mjerenja su provedena ili primjenom spektrofotometrijskoga testa ili praćenjem reakcije u vremenu mjerenjem koncentracije supstrata ili produkta primjenom tekućinske kromatografije. Jednostupanjske reakcije Sve reakcije uključene u sintezu prekursora bočnog lanaca statina provedene su u barem jednom od sljedećih reaktora: šaržnom reaktoru (BR), ponovljivom šaržnom reaktoru (RBR) ili šaržnom reaktoru s dotokom (FBR). Kada se reakcija provodila u RBR-u, dodavana je svježa količina supstrata ili enzima jednaka onoj početnoj u onome trenutku kada je koncentracija ili aktivnost pala na nulu. Kod reakcija koje su provedene u FBR-u, supstrati i/ili enzimi dovođeni su u reaktor pomoću klipnih pumpi (PHD 4400 Syringe Pump Series, Harvard Apparatus, SAD). Višeenzimski sustavi Nakon što su ispitane sve jednostupanjske reakcije uključene u sintezu prekursora, provedene su kaskadne reakcije. Višeenzimski sustavi sastojali su se od kombinacije različitih enzima u svrhu pojednostavljenja procesa sinteze bez pada produktivnosti. Reakcije su provedene ili u jednom reaktoru ili kao slijedne reakcije u odabranom tipu reaktora. Kod reakcija provedenih u jednom reaktoru, na početku eksperimenta dodani su svi supstrati, enzimi i koenzimi, a kod reakcija provođenih kao niz slijednih reakcija, svaki se sintetski korak gledao kao samostalna reakcija, što znači su se samo najnužniji supstrati, enzimi i koenzimi dodali prije sljedećeg sintetskog koraka, ali bez prethodnog pročišćavanja nastalih (među)produkata. Matematičko modeliranje, validacija i simulacije modela Matematički modeli sastoje se od kinetičkih i bilančnih jednadžbi, a razvijeni su na temelju reakcijske sheme, procijenjenih kinetičkih parametara i bilančnih jednadžbi za odabrani tip reaktora te su validirani na nezavisnom skupu eksperimentalnih podataka prikupljenih iz podataka prikupljenih u odgovarajućem tipu reaktora. Razvijeni modeli poslužili su u simulacijama i optimizaciji početnih parametara reakcije u svrhu dobivanja optimalne koncentracije glavnoga produkta i postizanja volumne produktivnosti. Obrada podataka Za procjenu kinetičkih parametara i konstante operacijske stabilnosti enzima korištene su simpleks-metoda i metoda najmannjih kvadrata primjenom računalnog programa Scientist (MicroMath), pri čemu se kao funkcija cilja koristila suma kvadrata odstupanja. Za potrebe simulacije primijenjen je algoritam Episode za rješavanje skupa diferencijalnih jednadžbi. Standardna devijacija i koeficijenti determinacije izračunati su primjenom statističkih funkcija ugrađenih u Scientist. Rezultati, rasprava i zaključci Da bi se utvrdili optimalni pufer i pH za provedbu enzimskih reakcija, ispitan je utjecaj različitih pufera i pH-vrijednosti na aktivnost i stabilnost enzima. Eksperimentalno je utvrđeno kako je optimalni pufer za provedbu reakcije aldolne adicije AA na CAA katalizirane DERATm-om 0.1 M pufer TEA-HCl, pH 7, dok je za istu reakciju kataliziranu DERA024-om najbolji 0.1 M fosfatni pufer, pH 6. Za reakciju oksidacije CDH-a katalizirane enzimom AlDH odabran je 0.1 M fosfatni pufer, pH 8. Za reakciju aldolne adicije AA na OPA katalizirane enzimom DERA062 utvrđeno je kako je optimalni pufer 0.1 M fosfatni pufer, pH 7, dok je za slijednu reakciju kataliziranu KRED354 optimalni isti pufer, ali pH 8. Ispitan je utjecaj temperature na aktivnost i stabilnost enzima DERATm. Rezultati su potvrdili kako aktivnost enzima raste s porastom temperature u skladu s Arrheniusovom jednadžbom. Pomoću prikupljenih eksperimentalnih podataka određeni su parametri jednadžbe. Enzim je pokazao vrlo dobru termostabilnost zadržavši 87 % inicijalne aktivnosti nakon tri dana inkubacije pri temperaturi 20 – 25 °C. Kako bi se uspješno postavili matematički modeli, bilo je potrebno odrediti utjecaj organskih spojeva (supstrata i produkata) na stabilnost enzima te odrediti kinetiku enzima u reakcijama koje kataliziraju. Konstanta deaktivacije enzima u prisustvu organskih spojeva za svaki pojedini enzim procijenjena je pomoću eksperimentalnih podataka vremenskih promjena aktivnosti enzima za svaku pojedinu koncentraciju pojedinačnog aldehida primjenom kinetike drugoga reda. Procijenjene konstante deaktivacije su potom prikazane kao ovisnost konstante deaktivacije o pojedinoj koncentraciji svakog ispitivanog spoja, te opisane polinomom. Rezultati ispitivanja utjecaja organskih spojeva na stabilnost enzima potvrdili su kako je nužno odrediti optimalne početne koncentracije supstrata te izbjeći akumulaciju spojeva koji imaju destabilizirajući učinak na enzime odabirom prikladne konfiguracije reaktora. Primjenom metode početnih brzina određena je kinetika svih enzima u svakoj pojedinoj reakciji unutar postavljenog višeenzimskog sustava. Kinetika svake pojedine enzimski katalizirane reakcije opisana je jednosupstratnom ili dvosupstratnom Michaelis-Menteničinom kinetikom. Ukoliko je bilo eksperimentalno utvrđeno, kinetičke jednadžbe bile su proširene članovima koji su se uključivali inhibicije uzrokovane supstratom i/ili produktom reakcije. Svi parametri Michaelis-Menteničine kinetike bili su procijenjeni primjenom nelinearne regresije programskog paketa Scientist (MicroMath). Uzimajući vrijednosti kinetičkih parametara u obzir, enzimi su se pogodnim katalizatorima istraživanih reakcija, međutim zaključeno je kako je za dvostruku aldolnu adiciju AA na CAA prikladniji enzim DERA024 nego enzim DERATm, a kako je za oksidaciju CDH-a prikladniji enzimski sustav kojeg čine AlDH/NOX009 nego enzim KRED332. U slučaju druge reakcijske rute, vezano uz regeneraciju koenzima NADP+ in situ, oba bi se enzima mogla uspješno koristiti u svrhu njegove regeneracije, pri čemu primjena enzima NOX001 pokazuje određene prednosti nad KRED011. Temeljem prikupljenih podataka ovisnosti stabilnosti enzima o prisustvu organskih spojeva u reakcijskoj otopini i razvijenih kinetičkih modela predloženi su matematički modeli za odgovarajući tip reaktora. Razvijeni matematički modeli validirani su u odgovarajućem reaktoru provedbom jednoenzimskih i višeenzimskih (kaskadnih) reakcija. Služeći se validiranim matematičkim modelima, optimirani su reakcijski uvjeti promatranih enzimski kataliziranih reakcija s ciljem proizvodnje industrijski relevantne količine ključnih molekula. U tu svrhu, kao mjerilo uspješnosti, poslužili su relevantni industrijski zahtjevi za proizvodnju finih kemikalija, poput količine proizvedenog produkta (> 50 g/L), konverzije supstrata (> 95 %, 24 h), iskorištenje biokatalizatora (> 10 gprodukt/genzim) i produktivnost (> 100 g/(L∙dan)). Kaskadne reakcije bile su provedene u odgovarajućem reaktoru na simultani (ako je uključivalo regeneraciju koenzima) i/ili sekvencijalni (ako su produkti prethodne reakcije bili supstrati sljedeće reakcije bez prethodne alternacije reakcijske otopine) način. Na temelju prikupljenih eksperimentalnih podataka, potvrđeno je kako je moguće pojednostaviti promatrane reakcijske sustave provedbom kaskadnih reakcija i time dobiti veće količine željenog produkta. Iako nije bilo moguće simultano provesti kaskadne reakcije koje uključuju enzime DERA i DH, iz razloga što enzimi DH neselektivno oksidiraju aldehide, eksperimentalno je potvrđeno kako je moguće provesti kaskadne reakcije na sekvencijalan način. Tako je provedbom sekvencijalne kaskade, koja uključuje prisustvo DERA024-e i AlDH/NOX009-a, reakcija rezultirala zadovoljavanjem industrijski značajnih procesnih veličina, u usporedbi s kaskadnom reakcijom provedenom u prisustvu DERA024-e i KRED332-a. Spomenute kaskade provedene su u šaržnom reaktoru, pri čemu su aldolne reakcije provedene s dodacima supstrata i enzima a reakcije oksidacije s dodacima enzima u trenutcima kada su se supstrati u potpunosti potrošili, odnosno kada je preostala aktivnost enzima bila ispod 20 %. Iako zbog kemijske reakcije aldehida s cijanidom nije bilo moguće provesti kaskadnu reakciju katalizirane s HHDH001 na simultan način (AlDH, NOX009 i HHDH001 dodani u istom stupnju), reakcija je provedena na sekvencijalni (po završetku reakcije katalizirane enzimskim sustavom AlDH/NOX009 dodana je HHDH001) način. Ta se kaskada sastojala od prvog stupnja (aldolna reakcija: DERA024, ponovljivi šaržni reaktor), drugog stupnja (reakcija oksidacije: AlDH/NOX009, šaržni reaktor s dodatcima enzima) i trećeg stupnja (reakcija katalizirana s HHDH001, u prisustvu KCN-a, šaržni reaktor), a demonstrirala je mogućnost uspješne provedbe kaskadne reakcije, kao i postizanje industrijskih zahtjeva za proizvodnju finih kemikalija. Provedbom kaskadne reakcije na sekvencijalni način, sačinjene od enzima DERA062 u prvom reakcijskom stupnju i KRED354 i NOX001 ili KRED011 u drugom stupnju, pri optimalnim reakcijskim uvjetima, dobiveni rezultati upućuju kako se oba enzima (NOX001 i KRED011) mogu uspješno koristiti u svrhu regeneracije koenzima NADP+. Zbog jednostavnosti i neznatno boljih rezultata, preporučeni regeneracijski sustav je onaj kataliziran enzimom NOX001. Eksperimentalno je utvrđeno da dolazi do raspada produkta oksidacije HOP-a, čime je dokazano kako nastala kiselina HOP nije stabilniji oblik aldehida DHP-a proizvedenog aldolnom adicijom. Time je dokazano kako oksidaciju trebalo provoditi simultano u prisustvu, na primjer, lipaze kako bi se zaobišao gubitak na produktu HOP, odnosno gubitak HOP-a kao supstrata sljedećeg, trećeg stupnja promatrane kaskade. Ekperimenti provedeni na temelju validiranih matematičkih modela rezultirali su s industrijski značajnim vrijednostima. Ti modeli predstavljaju dragocjenu osnovu za buduću primjenu promatranih kaskadnih sustava u svrhu proizvodnje prekursora bočnog lanca statina.