prikaz prve stranice dokumenta Expression optimization of ⍺-ketoglutarate dependent non-heme Fe(II) dioxygenases containing non-canonical amino acid in the facial triad
  Preuzmi
PDF 2.12 MB
diplomski rad
Expression optimization of ⍺-ketoglutarate dependent non-heme Fe(II) dioxygenases containing non-canonical amino acid in the facial triad
Zagreb: Sveučilište u Zagrebu, Prehrambeno-biotehnološki fakultet, 2021. urn:nbn:hr:159:499801
Smoljo, Josipa
Sveučilište u Zagrebu
Prehrambeno-biotehnološki fakultet
Zavod za biokemijsko inženjerstvo
Laboratorij za biokemijsko inženjerstvo, industrijsku mikrobiologiju i tehnologiju piva i slada

Institucijski repozitorij: Repozitorij Prehrambeno-biotehnološkog fakulteta u Zagrebu

Citirajte ovaj rad

Smoljo, J. (2021). Expression optimization of ⍺-ketoglutarate dependent non-heme Fe(II) dioxygenases containing non-canonical amino acid in the facial triad (Diplomski rad). Zagreb: Sveučilište u Zagrebu, Prehrambeno-biotehnološki fakultet. Preuzeto s https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:159:499801

Smoljo, Josipa. "Expression optimization of ⍺-ketoglutarate dependent non-heme Fe(II) dioxygenases containing non-canonical amino acid in the facial triad." Diplomski rad, Sveučilište u Zagrebu, Prehrambeno-biotehnološki fakultet, 2021. https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:159:499801

Smoljo, Josipa. "Expression optimization of ⍺-ketoglutarate dependent non-heme Fe(II) dioxygenases containing non-canonical amino acid in the facial triad." Diplomski rad, Sveučilište u Zagrebu, Prehrambeno-biotehnološki fakultet, 2021. https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:159:499801

Smoljo, J. (2021). 'Expression optimization of ⍺-ketoglutarate dependent non-heme Fe(II) dioxygenases containing non-canonical amino acid in the facial triad', Diplomski rad, Sveučilište u Zagrebu, Prehrambeno-biotehnološki fakultet, citirano: 20.11.2024., https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:159:499801

Smoljo J. Expression optimization of ⍺-ketoglutarate dependent non-heme Fe(II) dioxygenases containing non-canonical amino acid in the facial triad [Diplomski rad]. Zagreb: Sveučilište u Zagrebu, Prehrambeno-biotehnološki fakultet; 2021 [pristupljeno 20.11.2024.] Dostupno na: https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:159:499801

J. Smoljo, "Expression optimization of ⍺-ketoglutarate dependent non-heme Fe(II) dioxygenases containing non-canonical amino acid in the facial triad", Diplomski rad, Sveučilište u Zagrebu, Prehrambeno-biotehnološki fakultet, Zagreb, 2021. Dostupno na: https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:159:499801

Za citiranje koristite ovu mrežnu adresu: https://urn.nsk.hr/urn:nbn:hr:159:499801
Podaci o radu
NaslovExpression optimization of ⍺-ketoglutarate dependent non-heme Fe(II) dioxygenases containing non-canonical amino acid in the facial triad
Naslov (hrvatski)Optimizacija ekspresije α-ketoglutarat-ovisnih Fe(II) hem-neovisnih dioksigenaza s neprirodnom aminokiselinom u aktivnom mjestu
AutorJosipa Smoljo
MentorAnita Slavica (mentor)
Član povjerenstvaRenata Teparić (član povjerenstva)
Ustanova koja je dodijelila
akademski / stručni stupanj		Sveučilište u Zagrebu
Prehrambeno-biotehnološki fakultet
(Zavod za biokemijsko inženjerstvo)
(Laboratorij za biokemijsko inženjerstvo, industrijsku mikrobiologiju i tehnologiju piva i slada)
Zagreb
Datum i država obrane2021-04-30, Hrvatska
Znanstveno / umjetničko
područje, polje i grana		BIOTEHNIČKE ZNANOSTI
Biotehnologija
Sažetak
Expression of two L-leucine 5-hydroxylases, one isolated from Anabaena variabilis ATCC 29413 (AvLDO_wt) and second from Streptomyces muensis DSM 9461 (GriE_wt), were studied in two expression systems - pET28a(+) and pASKGATE. In vitro cloning methods FastCloning and Gateway® technology were performed in order to clone the genes in different vectors. Furthermore, site-directed mutagenesis QuikChange™ was done to clone the amber codon to the genetic code of the wild types at previously located sites, necessary for N-methylhistidine incorporation in the facial triad of the enzymes by the stop codon suppression methodology. The successful construction of these rationally designed enzymes was one of the rare examples of the incorporation of non-canonical amino acid in general, and N-methylhistidine specifically, in the active site of non-heme dioxygenases. Furthermore, the soluble expression of AvLDO and GriE (both wild types and mutants) was investigated using different concentrations of inducers and supplemented N-methylhistidine and successfully improved as observed by sodium dodecyl-sulfate polyacrylamide gel electrophoresis. Accordingly, the substrate scope of the GriE wild type and mutant was studied and assessed towards L-leucine and L-isoleucine by thin-layer chromatography.
Sažetak (engleski)
Ekspresija dviju L-leucin 5-hidroksilaza, jedne izolirane iz Anabaena variabilis ATCC 29413 (naziva AvLDO_wt) te druge izolirane iz Streptomyces muensis DSM 9461 (GriE_wt), proučavana je u dva plazmida - pET28a (+) i pASKGATE. In vitro metode kloniranja, FastCloning i Gateway® tehnologija primijenjene su zbog kloniranja gena u različite vektore. Nadalje, mjesno specifična mutageneza QuikChange™ primijenjena je kako bi se klonirao stop kodon na prethodno odabrane pozicije u genima AvLDO_wt i GriE_wt, što je neophodno za ugradnju N-metilhistidina u aktivno mjesto ovih enzima pomoću metodologije stop kodon supresije. Uspješna konstrukcija ovih racionalno dizajniranih enzima jedan je od rijetkih primjera ugradnje neprirodne aminokiseline općenito, a posebno N-metilhistidina, u aktivno mjesto hem-neovisnih dioksigenaza. Nadalje, istražena je ekspresija AvLDO i GriE (divljih tipova i mutanata) u topljivoj frakciji korištenjem različitih koncentracija induktora i N-metilhistidina te je uspješno poboljšana, kako je i potvrđeno poliakrilamid gel elektroforezom u prisutnosti natrijeva dodecil-sulfata. Također, tankoslojnom kromatografijom je proučavana aktivnost GriE divljeg tipa i mutanta, prema supstratima L-leucinu i L-izoleucinu.
Ključne riječi
Ključne riječi (engleski)
Jezikengleski
URN:NBNurn:nbn:hr:159:499801
Studijski programNaziv: Molekularna biotehnologija
Vrsta studija: sveučilišni
Stupanj studija: diplomski
Akademski / stručni naziv: magistar/magistra inženjer/inženjerka molekularne biotehnologije (mag. ing. biotechn.)
Vrsta resursaTekst
Način izrade datotekeIzvorno digitalna
Prava pristupaOtvoreni pristup
Uvjeti korištenjaIkona licence Imenovanje-Bez prerada 4.0 međunarodna (CC BY-ND 4.0)
Datum i vrijeme pohrane2021-06-08 11:56:30