| Sažetak | Cilj istraživanja: Proteini toplinskog stresa ( engl. heat shock proteins, HSP) prijenosničke su molekule koje vezuju peptide iz citosola i prenose ih u endoplazmatsku mrežicu na "MI-IC molekule. Osim uloge u savijanju proteina, HSP imaju važnu imunološku ulogu, napose HSP smješten u endoplazmatskom odjeljku, gp96. Istraživali smo ulogu gp96 u tumorskom modelu sekrecije gp96-Ig te na matemo-fetalnoj ploči prvog trimestra trudnoće. Ispitivali smo in vivo i in vitro utjecaj gp96-Ig na aktivaciju nespecifične i specifične imunosti. Na maternofetalnoj ploči prvog trimestra trudnoće istraživali smo prisutnost, raspodjelu te in vitro utjecaj gp96 na decidualne NK i dendritičke stanice.
Materijal i metode: U istraživanju smo koristili miševe genetički čistog soja C57Bl/6 (H-2b) te miševe iste genetske osnove (C57Bl/6) koji su deficijentni za jedan ili više gena: perforin (PKO), FasL (gld), perforin i FasL (Cdd), IFNy (GKO) te ovalbumin TCR transgenične miševe (OTI). Decidualno tkivo dobivali smo na Klinici za ginekologiju i porodništvo KBC Rijeka od žena koje su svojevoljno prekinule trudnoću u 6-1 O tjednu gestacijske dobi. U tumorskom modelu sekrecije gp96-Ig iz tumorskih stanica koje izražavaju ovalbumin (EG7gp96-Ig) određivali smo specifičan imunološki odgovor tako što smo u miševe adoptivno prenijeli ovalbumin reaktivne TCR transgenične CD8 limfocite (OTl stanice). Miševe smo potom imunizirali s EG 7 gp96-Ig te nakon 7., 14. i 21 . dana, u perifernoj krvi pratili broj OT 1 stanica, a putem ELISPOT-a određivali frekvenciju IFNy producirajućih stanica. Za određivanje specifičnih OTl stanica u perifernoj krvi koristili smo KbSIINFEKL tetramer (NIH Tetramer Facility, Washington DC) i protočnu citometriju. Također smo protočnim citometrom i testom proliferacije određivali utjecaj EG7gp96-Ig na in vivo i in vitro aktivaciju NK i dendritičkih stanica.
Decidualne mononuklearne stanice izdvojili smo enzimatskom razgradnjom tkiva i centrifugiranjem na gradijentu gustoće te analizirali fenotip decidualnih NK i dendritičkih stanica protočnom citometrijom. Imunohistologiju na smrznutom i u parafin uklopljenom decidualnom tkivu koristili smo za utvrđivanje raspodjele dendritičkih stanica te gp96 i njegovog receptora, CD91 molekule. Utjecaj gp96 na aktivnost decidualnih stanica određivali smo ispitivanjem utjecaja nekrotičnih i apoptotičnih K562 stanica na izraženost perforina i proliferaciju NK stanica u testu proliferacije neadherentnih decidualnih stanica, obilježenih CFSE fluorokromom, te ispitivanjem utjecaja nekrotičnih i apoptotičnih K562 stanica na izraženost CD86 i HLA-DR biljega na decidualnirn dendritičkim stanicama.
Rezultati: Tumorske stanice EG7 koje luče gp96-Ig in vivo, u C57Bl/6 miševa, dovode do aktivacije NK stanica i klonalne proliferacije specifičnih citotoksičnih CD8 limfocita. Istovjetan rezultat dobili smo i kod miševa deficijentnih za FasL, dok u miševa deficijentnih za perforin, dvostruko deficijentnih miševa za perforin i FasL te IFNy nije došlo do proliferacije NK stanica i CD8 limfocita. Deplecija NK stanica te in vivo blokiranje IFNa i f3 i IL-12 nije dovelo do proliferacije NK stanica i CD8 limfocita. Prijenos perforin kompetentnih NK stanica iz C57Bl/6 miša u perforin deficijentne životinje dovodi do rekonstitucije OTl proliferacije. Injiciranje EG7gp96-Ig u C57Bl/6 miša, dovodi do mobilizacije CDl lc pozitivnih stanica perifernu krv i to već unutar prvog tjedna. Također, EG7gp96-Ig in vitro dovodi do maturacije CDl lc pozitivnih stanica. U testu in vitro proliferacije, OTl stanice najviše proliferiraju pod istovremenom stimulacijom EG7gp96-Ig, dendritičkih i NK stanica. U populaciji svježe izdvojenih decidualnih mononuklearnih stanica najzastupljenije su decidualne NK stanice (CD56 positivne stanice) (60%). Udio CD83 pozitivnih stanica iznosi oko 1 %, dok je udio CD 1 a pozitivnih stanica jedva detektibilan na protočnom citometru. Tkivna raspodjela zrelih dendritičkih stanica upućuje na neposredan kontakt CD83 pozitivnih stanica i trofoblastnih stanica. Po prvi put smo dokazali prisustvo zrelih dendritičkih stanica osobitog fenotipa: uz CD83 biljeg izražavaju CD 14 i CD56 biljege. Tkivna raspodjela gp96 u decidualnom tkivu i korionskim resicama prvog trimestra trudnoće ukazuje da je riječ o heterogenoj distribuciji, s najvećom izraženošću u sinciciotrofoblastu i citotrofoblastu korionskih resica te u stanicama decidualnog tkiva koje morfološkom građom i specifičnom lokalizacijom odgovaraju ekstraviloznom i endovaskularnom citotrofoblastu. Receptor za gp96, CD91 molekula, izražena je na antigen prezentirajućim stanicama (CD83 pozitivne i HLA-DR pozitivne stanice) te na decidualnim NK stanicama (CD56 pozitivne stanice). Nekrotične K562 stanice, za razliku od apoptotičnih, dovode do aktivacije decidualnih NK i dendritičkih stanica ( ushodno regulirana proliferacija i izraženost perforina decidualnih NK stanica, te ushodna izraženost CD86 i HLA-DR molekule na decidualnim CD83 pozitivnim stanicama). Učinke nekrotičnih K562 stanica moguće je djelomično blokirati protu-gp96 protutijelom, dok kombinacija protu-gp96 i protu-CD91 protutijela dovodi do potpunog izostanka ushodnog izražavanja HLA-DR biljega na CD83 pozitivnim stanicama.
Zaključak: Izlazak gp96 iz stanice, od strane imunološkog sustava interpretira se kao signal opasnosti te dolazi do lučenja proupalnih citokina, aktivacije nespecifične i specifične 1munosti (dendritičkih stanica, NK stanica i cititoksičnih CD8 limfocita). Gp96-Ig, perforinom posredovanim mehanizmom, dovodi do prekidanja uspostavljenog stanja tolerancije na tumor. Budući da na materno-fetalnoj ploči korionske resice prvog trimestra (sincicio i citotrofoblast) sadrže najviše gp96, moguće je da izlazak gp96 iz trofoblastnih stanica potiče aktivaciju imunokompetentinh majčinih stanica ( decidualnih NK stanica i dendritičkih stanica) putem CD91 molekule. |
