UVOD: Kolibaciloza predstavlja značajan problem u peradarskoj industriji, uzrokujući velike ekonomske gubitke i smanjenje dobrobiti životinja na farmama. Uzrokovana je bakterijom Escherichia coli (E. coli), koja može biti primarni ili sekundarni patogen, često u koinfekciji s drugim mikroorganizmima kao što su Mycoplasma ili virus zaraznog bronhitisa, ili uslijed različitih oblika imunosupresije. Težina infekcije ovisi o različitim čimbenicima kao što su soj, mjesto ulaska patogena i opće zdravstveno stanje životinje. U pilića zaraza najčešće nastaje putem nezacijeljenog pupčanog tračka u valionici ili vertikalnim prijenosom od zaraženog roditeljskog jata. Kod kokoši u proizvodnji, najčešće lezije uključuju poliserozitis, peritonitis, salpingitis i salpingitisperitonitis sindrom (SPS), pri čemu infekcija nastaje ascendentno putem jajovoda. Iako infekcija može biti lokalizirana, češće se radi o sistemskoj infekciji, odnosno septikemiji. Izbijanje bolesti je vrlo često povezano s početkom proizvodnje jaja, pa se septikemija kod kokoši nesilica smatra bolešću koja je potaknuta stresom. Sojevi E. coli mogu se podijeliti u crijevne i izvancrijevne (engl. extraintestinal pathogenic E. coli, ExPEC), pri čemu ptičji patogeni sojevi (engl. avian pathogenic E. coli, APEC) pripadaju skupini izvancrijevnih sojeva. Svi ExPEC sojevi sadržavaju čimbenike virulencije koji im omogućavaju preživljavanje i kolonizaciju tkiva izvan crijeva, ali su genetski vrlo raznoliki, što komplicira detaljnu klasifikaciju i dijagnostiku. Geni virulencije u APEC sojevima vrlo često su grupirani na otocima patogenosti (engl. pathogenicity islands, PAIs) koji mogu biti smješteni na kromosomima ili plazmidima. S obzirom da izrazito virulentni APEC sojevi vrlo često sadržavaju takve plazmide, oni se smatraju njihovom karakteristikom, iako dosadašnjim istraživanjima nije uspješno utvrđeno koji pojedini geni virulencije su svojstveni za APEC sojeve. Rezultati istraživanja različitih ExPEC podskupina pokazali su da su svi takvi sojevi genetski vrlo slični, što je stvorilo temelj za istraživanje zoonotskog potencijala APEC sojeva. U svrhu tipizacije sojeva E. coli korištene su mnoge metode, od kojih se u današnje vrijeme vrlo često primjenjuje filogenetska tipizacija temeljena na dokazu gena koji se smatraju reprezentativnima za pojedine filogenetske skupine. Prema trenutnoj podjeli, postoji osam skupina, te tzv. „cryptic clade“ I-V, pri čemu se skupine B2, D, F i G smatraju patogenima, dok ostale čine komenzalni sojevi. Primjena takve metode omogućava brzu dijagnostiku i monitoring sojeva E. coli na farmama. U istraživanjima i dijagnostici, sve češće se primjenjuje tehnologija sekvenciranja novih generacija (engl. next-generation sequencing, NGS), koja ima veliki potencijal u populacijskoj genomici i molekularnoj epidemiologiji. Primjenom metoda sekvenciranja moguće je pratiti evoluciju bakterijskih populacija, te njihovu prilagodbu različitim domaćinima. Zaštita peradi na farmama temelji se na provedbi strogih biosigurnosnih mjera i primjeni cjepiva. S obzirom da su sojevi E. coli genetski vrlo raznoliki, komercijalne vrste cjepiva su često nedovoljno učinkovite jer pružaju zaštitu od nekolicine sojeva. Iz toga razloga, sve češće se koriste autogena cjepiva koja su proizvedena od sojeva izdvojenih na farmama na kojima će se i primjenjivati, pa su zato vrlo specifična i učinkovita. Dosadašnja istraživanja pokazala su da primjena autogenoga cjepiva ima pozitivan utjecaj na zdravlje životinja i njihove proizvodne rezultate. Longitudinalnim praćenjem genetske strukture populacije E. coli na farmama na kojima se primjenjuje autogeno cjepivo, može se dobiti uvid o utjecaju cjepiva na raznolikost i virulenciju sojeva. HIPOTEZA: Osnovni cilj bio je istražiti utjecaj primjene autogenoga cjepiva na genski sastav i selekciju sojeva E. coli. Analiza longitudinalno izdvojenih sojeva omogućila bi detekciju genskih varijacija kroz nekoliko jata, uzimajući u obzir utjecaj primjene autogenoga cjepiva. Hipoteza istraživanja bila je da kontinuirano cijepljenje jata autogenim cjepivom utječe na gensku heterogenost i profile virulencije E. coli. MATERIJALI I METODE: Istraživanje je provedeno na ukupno 115 sojeva E. coli izdvojenih iz lešina kokoši s dvije odvojene farme roditeljskih jata teške linije genetike Ross 308. Sojevi su izdvojeni iz četiri i pet jata, na Farmi A, odnosno Farmi B, koje su dio iste tvrtke. Obje farme imale su kontinuirane probleme uzrokovane temelju morfološke pretrage i biokemijskih karakteristika, a potvrđena MALDI-TOF metodom masene spektrometrije (engl. matrix-assisted laser desorption/ionization- time of flight mass spectrometry). Svi uzorci su čuvani u Brain Heart Infusion bujonu s dodatkom 50%-tnog glicerola pri temperaturi od -20 ºC. Odabir sojeva za daljnje analize temeljen je na organu podrijetla i dobi životinje. Ciljani organi bili su peritoneum, jetra, jajovod i koštana srž, s obzirom da su najčešće zahvaćeni u slučajevima kolibaciloze. Kada sojevi iz odabranih organa nisu bili dostupni, analizirani su sojevi iz drugih često zahvaćenih tkiva kao što su pluća i perikard. Svi uzorci izdvojeni su iz životinja starijih od 21 tjedna, kada najčešće dolazi do izbijanja bolesti. Sojevi su uspoređivani na temelju filogenetskih skupina, održavateljskih gena (engl. housekeeping genes), skupine odabranih gena virulencije koji su prethodno istraživani kao moguće odrednice virulencije ExPEC sojeva, detektiranih stečenih gena rezistencije, te jednonukleotidnih polimorfizama (engl. single-nucleotide polymorphism, SNP) čitavog genoma istraživanih sojeva. REZULTATI I DISKUSIJA: Rezultati istraživanja pokazali su postepeno smanjivanje genske heterogenosti sojeva E. coli nakon kontinuirane primjene autogenoga cjepiva. Tipizacija sojeva u filogenetske skupine pokazala je nešto veću prevalenciju komenzalnih sojeva na Farmi A (49.02%) – uzimajući u obzir i udio netipiziranih sojeva (5.88%). Na Farmi B bili su značajno učestaliji patogeni sojevi (82.3%), te je posljednje jato bilo izrazito homogeno sa 100%-tnom prevalencijom skupine B2. Na Farmi A došlo je i do porasta prevalencije komenzalnih sojeva, to jest skupine „cryptic clade“ u posljednjem jatu (46.2%), koju karakterizira fiziološki visoka prevalencija u probavnom sustavu ptica. Filogenetske analize temeljene na MLST (engl. multilocus sequence typing) i cgSNP (engl. core-genome single-nucleotide polymorphism) metodama potvrdile su da primjena autogenoga cjepiva uzrokuje smanjenje heterogenosti sojeva, dok je analiza gena virulencije pokazala suprotno. Kontinuirana primjena cjepiva na Farmi A dovela je do značajnog porasta prosječnog broja gena virulencije po izolatu kroz vrijeme, dok se na Farmi B, usprkos početnom porastu, taj broj do kraja istraživanja blago smanjio. Uspoređujući prosječan broj gena virulencije svih jata, na Farmi B je od početka bio značajno veći nego na Farmi A. Pojedini čimbenici virulencije prethodno vezani isključivo uz uropatogene sojeve (engl. uropathogenic E. coli, UPEC), dokazani su u, zbog čega je započeta primjena autogenoga cjepiva. Prvo jato na obje farme cijepljeno je komercijalnim cjepivom, dok je primjena autogenoga cjepiva posebno dizajniranog za svako jato započela u drugom jatu. Uzorci su prikupljeni tijekom patomorfoloških pretraga uginulih kokoši u sklopu kontinuiranog nadzora na farmi i u slučaju izbijanja bolesti. Uzorci su uključivali obriske makroskopski promijenjenih organa, te su nasađeni na tri vrste čvrstih hranjivih podloga. Identifikacija bakterija provedena je na temelju morfološke pretrage i biokemijskih karakteristika, a potvrđena MALDI-TOF metodom masene spektrometrije (engl. matrix-assisted laser desorption/ionization- time of flight mass spectrometry). Svi uzorci su čuvani u Brain Heart Infusion bujonu s dodatkom 50%-tnog glicerola pri temperaturi od -20 ºC. Odabir sojeva za daljnje analize temeljen je na organu podrijetla i dobi životinje. Ciljani organi bili su peritoneum, jetra, jajovod i koštana srž, s obzirom da su najčešće zahvaćeni u slučajevima kolibaciloze. Kada sojevi iz odabranih organa nisu bili dostupni, analizirani su sojevi iz drugih često zahvaćenih tkiva kao što su pluća i perikard. Svi uzorci izdvojeni su iz životinja starijih od 21 tjedna, kada najčešće dolazi do izbijanja bolesti. Sojevi su uspoređivani na temelju filogenetskih skupina, održavateljskih gena (engl. housekeeping genes), skupine odabranih gena virulencije koji su prethodno istraživani kao moguće odrednice virulencije ExPEC sojeva, detektiranih stečenih gena rezistencije, te jednonukleotidnih polimorfizama (engl. single-nucleotide polymorphism, SNP) čitavog genoma istraživanih sojeva. REZULTATI I DISKUSIJA: Rezultati istraživanja pokazali su postepeno smanjivanje genske heterogenosti sojeva E. coli nakon kontinuirane primjene autogenoga cjepiva. Tipizacija sojeva u filogenetske skupine pokazala je nešto veću prevalenciju komenzalnih sojeva na Farmi A (49.02%) – uzimajući u obzir i udio netipiziranih sojeva (5.88%). Na Farmi B bili su značajno učestaliji patogeni sojevi (82.3%), te je posljednje jato bilo izrazito homogeno sa 100%-tnom prevalencijom skupine B2. Na Farmi A došlo je i do porasta prevalencije komenzalnih sojeva, to jest skupine „cryptic clade“ u posljednjem jatu (46.2%), koju karakterizira fiziološki visoka prevalencija u probavnom sustavu ptica. Filogenetske analize temeljene na MLST (engl. multilocus sequence typing) i cgSNP (engl. core-genome single-nucleotide polymorphism) metodama potvrdile su da primjena autogenoga cjepiva uzrokuje smanjenje heterogenosti sojeva, dok je analiza gena virulencije pokazala suprotno. Kontinuirana primjena cjepiva na Farmi A dovela je do značajnog porasta prosječnog broja gena virulencije po izolatu kroz vrijeme, dok se na Farmi B, usprkos početnom porastu, taj broj do kraja istraživanja blago smanjio. Uspoređujući prosječan broj gena virulencije svih jata, na Farmi B je od početka bio značajno veći nego na Farmi A. Pojedini čimbenici virulencije prethodno vezani isključivo uz uropatogene sojeve (engl. uropathogenic E. coli, UPEC), dokazani su u velikom broju istraživanih izolata, što je također jedan od mogućih pokazatelja da infekcija može nastati ascendentno putem jajovoda. Detektiran je porast prevalencije čimbenika virulencije s funkcijom vezanja i transporta željeza na obje farme. U usporedbi s drugim skupinama gena virulencije, udio čimbenika transporta željeza bio je značajno viši. Također je detektirana visoka prevalencija toksin-kodirajućih gena (>85%), pa tako i bakteriocina, što ukazuje na kompetitivni fenotip istraživanih bakterija, te moguću dominaciju jednog ili nekoliko sojeva prilikom izbijanja kolibaciloze na farmama. Osobitosti virulencije sojeva zavisne su o dokazanim ST profilima (engl. sequence type), potvrđujući mogućnost primjene MLST metode u istraživanju raznolikosti virulencije sojeva E. coli. Suprotno tome, pojavnost gena antimikrobne rezistencije (AMR) nije bila specifična za određeni ST. Analiza gena AMR pokazala je najvišu prevalenciju gena mdf(A) (100%) i sit operona (71.3%). Ekspresija gena mfd(A) omogućava multirezistentnost sojeva na različite skupine antimikrobnih pripravaka, što ukazuje na to da su se sojevi prilagodili uvjetima okoliša posjedovanjem gena AMR širokog spektra. S druge strane, sit operon geni bitni su čimbenici virulencije zbog njihove funkcije u vezanju i transportu metalnih iona i rezistenciji na vodikov peroksid, što predstavlja važnu ulogu u patogenezi kolibaciloze. Prevalencija većine ostalih detektiranih AMR gena bila je značajno niža, te je iznosila do 4.35%, osim za gen tet(A) koji je detektiran u ukupno 17 izolata (14.78%). Praćenjem frekvencije AMR kroz vrijeme može se uočiti pad prevalencije, što je zasigurno i rezultat primjene autogenoga cjepiva koje je smanjilo potrebu za primjenom antimikrobnih pripravaka u svrhu terapije kolibaciloze na istraživanim farmama. ZAKLJUČAK: Primjena autogenoga cjepiva utjecala je na prevalenciju filogenetskih skupina istraživanih izolata E. coli, pri čemu je došlo do eliminacije slabije virulentnih sojeva homolognih cijepnim sojevima i perzistencije patogenih, ali uz uspješnu kontrolu kliničke manifestacije na farmama. Kontinuirana primjena uzrokovala je smanjenje genetske raznolikosti sojeva, što je dokazano Clermont metodom filotipizacije, te filogenetskim analizama temeljenima na MLST i cgSNP metodama. Suprotno tome, nije došlo do smanjenja genske raznolikosti čimbenika virulencije. Prosječan broj navedenih gena na Farmi A se značajno povećao, dok se na Farmi B blago smanjio. Profili gena virulencije odgovarali su specifičnim ST-ovima i filogenetskim skupinamaE. coli. Detektirana su 23 ST profila, od čega su ST95, ST117, ST390 i ST23 činili 62.61% od ukupnog broja izolata. Od navedenih, ST95, ST390 i ST131 imali su najveći prosječan broj gena virulencije po izolatu. Dok je većina ST profila bila prisutna samo na jednoj farmi, ST117 je izdvojen na objema farmama, što ukazuje na mogućnost vertikalnog prijenosa iz djedovskih jata ili uzgojnih peradnjaka. Analiza gena antimikrobne rezistencije pokazala je najveću zastupljenost gena mdf(A) i sit operona, koji pružaju zaštitu protiv širokog spektra antimikrobnih pripravaka i omogućavaju patogenezu same infekcije. Ostali geni AMR detektirani su u bitno manjem broju i njihova pojavnost nije bila vezana uz specifičan ST. Rezultati ukazuju i na mogući sinergistički učinak terapije i autogenoga cjepiva čime se slabije virulentni ali rezistentniji sojevi uspješno kontroliraju imunosnim sustavom potaknutim cjepivom, dok se patogeni ali manje rezistentni sojevi u slučaju izbijanja bolesti mogu kontrolirati terapijom.